论文摘要
肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,居恶性肿瘤死因的首位,其发病率及死亡率呈逐年上升的趋势。目前对肺癌的治疗方法有手术、放疗和化疗等,尽管这些治疗手段技术上均有了长足的进步,但是由于肺癌发生的分子机制及病理过程较为复杂,其5年生存率无明显提高,因此亟待探索新的肺癌治疗手段。光动力治疗（photodynamictherapy,PDT）是一种在有氧条件下,通过一定波长的激光激发靶细胞内光敏剂产生活性氧物质（reactive oxygen species,ROS）直接损伤肿瘤细胞、使微血管受损造成癌组织血流灌注减少的抗肿瘤新方法。但由于肿瘤细胞可能对其治疗过程中的氧化损伤及DNA损伤均具有一定的自身修复作用,影响了PDT对肿瘤的疗效。脱嘌呤/脱嘧啶核酸内切酶（apurinic apyrimidinic endonuclease,APE1）具有DNA损伤修复和氧化还原双功能,能通过调节生物体对氧化应激和缺氧的适应性,最大限度地减少细胞损伤。本研究以APE1为靶点,通过Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒,研究其体内对A549细胞感染效率和对APE1基因表达的“敲除”作用,及其体内及体外增强肺癌PDT敏感性的作用及机制。研究目的1.探讨APE1在非小细胞肺癌（non-small cell lung carcinomas,NSCLC）中的表达特点及其与患者预后的关系,为NSCLC以APE1靶点的基因治疗提供临床理论依据;2.探讨以APE1为靶点的基因治疗联合PDT在肺癌治疗中的临床应用前景。研究内容和方法1.APE1在NSCLC组织中表达及其临床意义:采用免疫组化方法检测NSCLC组织APE1蛋白表达特点,分析APE1表达高低与预后的关系,为进一步以APE1为靶点的基因治疗提供临床病理基础。2.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合PDT对A549细胞杀伤效应的实验研究:采用流式细胞术检测Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒对A549细胞感染效率;Westernblot检测其对A549细胞APE1基因的沉默作用;采用[γ-32P]ATP标记寡核苷酸法检测Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒对A549细胞AP内切酶活性的抑制作用;通过MTT来检测PDT及Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合PDT对A549细胞增殖抑制作用;流式细胞检测细胞凋亡;彗星实验检测DNA损伤;Western blot检测APE1蛋白及VEGF蛋白的表达。3.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合PDT对A549细胞裸鼠移植瘤抑瘤作用的实验研究:建立肺腺癌A549细胞裸鼠移植瘤动物模型,观察Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合PDT对肺癌生长抑制的协同作用,TUNEL法检测肿瘤细胞细胞凋亡。研究结果1.APE1在NSCLC组织表达及其临床意义:正常肺组织及NSCLC组织均有APE1表达,但其表达的定位有所区别,正常肺组织以胞核表达为主,NSCLC组织以胞浆表达为主,两者之间差异性显著（P＜0.01）;通过Kaplan-Meier生存分析提示:APE1高低表达组之间生存时间有显著性差异,APE1低表达组中位生存时间为35±5.196个月,APE1高表达组中位生存期为26±0.761个月。2.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒对A549细胞生物效应的实验研究:10 MOI的Ad5/F35-APE1 siRNA腺病毒对A549细胞的感染效率可达98%;Ad5/F35-APE1siRNA呈剂量依赖性地抑制A549细胞APE1蛋白表达,且能显著抑制A549细胞的AP内切酶活性。3.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒增强A549细胞PDT治疗敏感性及机制的实验研究:Ad5/F35-APE1 siRNA联合PDT能显著增强A549细胞的增殖抑制作用;Ad5/F35-APE1 siRNA增加PDT诱导的A549细胞凋亡;碱性彗星分析结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA抑制PDT后A549癌细胞DNA修复能力;PDT可诱导A549细胞APE1及VEGF蛋白表达增强,但通过Ad5/F35-APE1 siRNA可抑制A549细胞PDT诱导的APE1及VEGF蛋白的表达。4.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合PDT对A549细胞裸鼠移植瘤抑瘤作用的实验研究:体内实验结果显示Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组肿瘤生长较单纯PDT组明显被抑制,单纯Ad5/F35-APE1 siRNA组肿瘤抑制率为34.85%,单纯PDT组肿瘤抑制率为52.19%,Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组肿瘤抑制率为93.97%。TUNEL检测肿瘤细胞凋亡情况,显示Ad5/F35-APE1 siRNA+PDT组肿瘤细胞凋亡率为（24.68±2.47）%,显著高于Ad5/F35-APE1 siRNA感染组（6.24±1.32）%、单独PDT组（12.12±1.76）%以及对照组（3.37±1.28）%（p＜0.01）。结论1.APE1在NSCLC中有胞浆异位表达的倾向,且APE1表达的高低与肺癌的预后有关。2.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒容易感染肺腺癌A549细胞,且可特异性抑制A549细胞APE1蛋白表达,抑制A549细胞的AP内切酶活性。3.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒能显著增强A549细胞PDT敏感性,主要是通过两种机制实现的,一方面通过抑制A549细胞PDT后的DNA损伤修复能力;另一方面通过抑制A549细胞对PDT所致氧化损伤的修复能力。4.PDT可诱导A549细胞APE1蛋白表达增强,但通过Ad5/F35-APE1 siRNA可抑制PDT诱导的APE1蛋白的表达。5.Ad5/F35-APE1 siRNA重组腺病毒联合PDT对A549细胞裸鼠移植瘤的抑瘤作用较单独PDT更为明显。
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