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F1代法监测田间棉铃虫对转Bt基因棉的抗性

2020-11-28阅读(136)

F1代法监测田间棉铃虫对转Bt基因棉的抗性

论文摘要

一、棉铃虫抗性品系的筛选及抗性等位基因频率的鉴定继续采用转Bt基因棉叶喂饲法对棉铃虫室内抗性品系YCR进行筛选,从第73代至88代,该品系对Bt毒素的抗性从2523倍上升到7311倍,继续筛选到104代,保持着极高水平抗性。采用等位基因特异性PCR技术（PASA）对室内抗性品系棉铃虫的钙粘素大片断缺失基因（r1）进行鉴定,其基因型r1r1,且其频率为1。二、建立抗性棉铃虫的检测标准室内比较了棉铃虫抗、感亲本及正反交后代在转Bt基因棉叶上5天的发育速率。结果表明:抗、感亲本及正反交后代在转Bt基因棉叶上5天的存活率与发育速率存在明显差异,抗性品系的存活率达到75%,其中65%（存活幼虫的87%）存活幼虫龄期达2龄中期以上,体重≥0.6 mg/头,正反交和敏感品系的存活率仅为6%（活虫体重0.1-0.5mg/头,龄期为1-2龄初）、2%（活虫体重0.1-0.3 mg/头,龄期为1龄）及0%。因此,确定棉铃虫在转Bt基因棉叶上5天发育到2龄中期以上、体重≥0.6 mg/头的个体作为判别抗性纯合子的标准。三、棉铃虫在转Bt基因棉上发育速率的研究采用叶片喂饲法比较抗性品系和敏感品系在转Bt基因棉和常规棉上的生长发育,结果表明:在室内条件下,该高抗品系棉铃虫用转Bt基因棉和常规棉叶片喂饲5天的存活率差异不显著,均为80%以上;继续喂饲棉叶,抗性棉铃虫在转Bt基因棉叶上能够完成整个生长发育,但仅有6.7%的羽化率。在转Bt基因棉上幼虫历期较在常规棉上长6天,其化蛹率、蛹重、羽化率等均较常规棉低,表明抗性品系在转Bt基因棉上生长发育存在明显的生存劣势。由于抗性与敏感棉铃虫生长发育的速率不一致以及在一个长期的转基因作物的选择压力下产生高抗的棉铃虫能够在转Bt基因棉上存活,并有少量个体能完成整个生长发育,这将影响到庇护区内大量发育速率快的敏感个体与转Bt基因棉田少量发育速率慢的抗性个体的正常随机交配,从而可能削弱了庇护区治理策略的治理效果。四、棉铃虫对转Bt基因棉的抗性遗传及抗性连锁分析采用饲料感染法测定了21%MVPII可湿性粉剂（WP）和20%MVPII胶悬剂（SC）对棉铃虫抗（YCR）、感（YCS）亲本及其正反交（F1,F′1）后代的毒力,21%MVPIIWP对正反交后代的毒力分别为12.031（95%CI:7.972-18.263）μg/mL和6.617（95%CI:4.337-9.960）μg/mL;20%MVPII SC对正反交后代的毒力分别为61.659（95%CI:43.05-90.55）和98.22（95%CI:76.73-123.65）μg/mL。两毒素对正反交后代的毒力差异均不显著（95%置信限重叠）,表明其抗性为常染色体遗传。根据Stone公式计算得到21%MVPII WP对正反交后代的显性度分别为-0.51和-0.69（20%MVPII SC的显性度分别为-0.61和-0.44）,二者均在-1～0之间,证实具有7000多倍极高水平抗性的YCR品系对Cry1Ac的抗性基因（r1）为不完全隐性遗传。正交后代雌虫与抗性亲本雄虫回交（BC1）后代、正交后代雄虫与抗性亲本雌虫回交（BC2）后代分别用转Bt基因棉叶处理5d后,其基因型分离比例接近1∶1,经分子检测得到进一步验证,证明棉铃虫对转Bt基因棉的钙粘素大片断缺失基因（r1）也是常染色体遗传,且该钙粘素大片断缺失基因（r1）与抗性紧密连锁。五、田间棉铃虫的抗性监测2005、2006、2007年从河北邱县和威县（2005年）转Bt基因棉大田灯诱采集第二代棉铃虫雄虫采用F1代法在室内用转Bt基因棉植株或棉叶喂饲法检测田间棉铃虫对表达单价Cry1Ac毒素的转Bt基因棉的抗性等位基因频率。三年期间分别检测了来自邱县棉田86、127和135头雄虫,其中分别有8、24和29头田间亲本检测到携带抗性等位基因,估测抗性等位基因的频率分别为0.047（95%CI:0.015-0.079）、0.094（95%CI:0.044-0.145）和0.107（95%CI:0.055-0.159）;2005年采用F1代法检测威县32头田间雄性成虫检测到1头携带有抗性等位基因,其抗性等位基因频率为0.016（0-0.0595）。2005年采用F2代法从邱县131头田间雌性成虫中检测到7头携带有抗性等位基因,其频率值为0.01539（95%CI:0.0067-0.0277）,单雌系抗性等位基因检出概率值(1-PNO)为93.8%。2005年两种方法检测邱县的结果基本一致,说明F1和F2代法均能检测到田间稀少的、携带隐性抗性杂合子的个体,与F2代法相比,F1代法是更为有效、经济、实用的田间抗性检测方法。在2007年又用剂量-反应法测定田间种群的抗性。结果表明:该种群对20%MVPII SC产生13.14倍抗性,为中等水平抗性。这些结果警示邱县棉铃虫种群的抗性已明显上升,长期大面积种植表达单价Cry1Ac毒素的转Bt基因棉和缺少非Bt棉做为有效庇护区可能加速了田间抗性进化,应在该地区尽快制定和实施有效的抗性治理策略。

论文目录

  • 摘要
  • ABSTRACT
  • 第一章 文献综述
  • 1 棉铃虫的危害及抗药性
  • 1.1 棉铃虫的种类及分布
  • 1.2 棉铃虫的生物学习性及发生危害
  • 1.3 棉铃虫的抗药性
  • 2 苏云金芽孢杆菌
  • 2.1 苏云金芽孢杆菌概述
  • 2.2 苏云金芽孢杆菌的来源和分类
  • 2.3 杀虫晶体蛋白（Insecticide Crystal Protects,ICPs）
  • 2.4 ICP的结构与功能关系
  • 2.5 毒素的杀虫机理
  • 3 转Bt基因作物的研究与应用
  • 3.1 转基因作物的研究
  • 3.2 转Bt基因作物的种植情况
  • 3.3 转Bt基因棉的安全性
  • 4 害虫对转Bt基因作物的抗性研究进展
  • 4.1 室内品系的抗性研究
  • 4.2 田间种群的抗性研究
  • 4.3 害虫对Bt毒素及转Bt基因棉抗性机理的研究
  • 4.3.1 氨肽酶N（aminopeptidase N,APN）
  • 4.3.2 类钙粘蛋白（cadherin-like protein）
  • 4.3.3 糖酯类（glycolipids）受体
  • 4.3.4 碱性磷酸酶（alkaline phosphatase,Alp）
  • 5 害虫对转基因作物的抗性检测和监测
  • 5.1 生物检测技术
  • 5.1.1 剂量—反应检测技术
  • 5.1.2 区分剂量法
  • 1代筛选法'>5.1.3 F1代筛选法
  • 1代筛选法（简称F1代法）'>5.1.4 单对杂交F1代筛选法（简称F1代法）
  • 2代筛选法（简称F2代法）'>5.1.5 F2代筛选法（简称F2代法）
  • 5.1.6 试验小区法
  • 5.1.7 田间调查结合室内生测法
  • 5.2 分子检测技术
  • 5.2.1 等位基因特异性PCR技术（PASA技术）
  • 5.2.2 PCR限制性内切酶法（REN-PCR）
  • 5.2.3 单链构型多态型分析技术（SSCP）
  • 5.2.4 微测序（minisequencing）
  • 5.3 生物化学监测和免疫学检测法
  • 6 害虫对转Bt基因作物抗性的治理策略
  • 6.1 庇护区策略
  • 6.2 应用基因工程技术
  • 6.2.1 开发新的强毒力的毒素基因
  • 6.2.2 培育转多种杀虫基因作物
  • 6.2.3 转基因植物毒蛋白表达的基因调控
  • 6.2.4 调整转基因作物中毒素表达量
  • 6.3 建立有效的害虫抗性检（监）测体系和危险性评价系统
  • 7 本文立题背景与意义
  • 第二章 棉铃虫抗性品系的筛选及其抗性等位基因频率的鉴定
  • 1 材料与方法
  • 1.1 供试材料
  • 1.1.1 供试棉铃虫
  • 1.1.2 供试转Bt基因棉品种
  • 1.1.3 Bt毒素
  • 1.1.4 供试试剂与仪器
  • 1.2 试验方法
  • 1.2.1 棉铃虫对转Bt基因棉抗性筛选
  • 1.2.1.1 抗性品系选育
  • 1.2.1.2 抗性测定方法
  • 1.2.2 采用等位基因特异性PCR技术（PASA）检测YCR抗性等位基因频率
  • 2 结果与分析
  • 2.1 棉铃虫对转Bt基因棉抗性筛选
  • 2.2 棉铃虫对Bt毒素的抗性测定
  • 1）频率的鉴定'>2.3 抗性品系的抗性基因（r1）频率的鉴定
  • 3 讨论
  • 第三章 棉铃虫在转Bt基因棉上发速率的研究
  • 1 材料与方法
  • 1.1 供试材料
  • 1.1.1 供试棉铃虫
  • 1.1.2 供试棉花品种
  • 1.2 试验方法
  • 1.2.1 抗性棉铃虫在转Bt基因棉上5天的发育速率标准的建立
  • 1.2.2 采用等位基因特异性PCR技术验证抗性标准
  • B和苏棉12#上的生长发育比较'>1.2.3 抗性品系在新棉33B和苏棉12#上的生长发育比较
  • 2 结果与分析
  • 2.1 抗性棉铃虫在转Bt基因棉上5天的发育速率标准
  • 2.2 等位基因特异性PCR技术验证抗性标准
  • 2.3 棉铃虫在转Bt基因棉和常规棉上的生长发育比较
  • 3 讨论
  • 第四章 棉铃虫对转Bt基因棉的抗性遗传及抗性连锁分析
  • 1 材料与方法
  • 1.1 试验材料
  • 1.1.1 供试棉花
  • 1.1.2 供试棉铃虫
  • 1.1.3 供试毒素
  • 1.2 试验方法
  • 1.2.1 毒力测定
  • 1.2.2 抗性连锁分析
  • 2 结果与讨论
  • 2.1 抗性遗传分析
  • 2.2 抗性基因连锁分析
  • 3 讨论
  • 第五章 田间棉铃虫的抗性监测
  • 1 材料与方法
  • 1.1 供试材料
  • 1.1.1 供试棉铃虫
  • 1.1.2 供试转Bt基因棉
  • 1.1.3 供试毒素
  • 1.1.4 采样地点及田间取样
  • 1.2 试验方法
  • 1代检测法'>1.2.1 F1代检测法
  • 1代检测'>1.2.1.1 F1代检测
  • 2代生物法核查'>1.2.1.2 F2代生物法核查
  • 1.2.1.3 采用等位基因特异性PCR技术鉴定田间亲本基因型
  • 2代检测法'>1.2.2 F2代检测法
  • 1.2.3 区分（诊断）剂量检测法
  • 1.2.4 剂量-反应检测法
  • 1.2.5 数据统计分析
  • 2 结果与分析
  • 1代法检测田间抗性等位基因频率'>2.1 F1代法检测田间抗性等位基因频率
  • 1代检测'>2.1.1 F1代检测
  • 2代生物遗传核查'>2.1.2 F2代生物遗传核查
  • 2.1.3 应用等位基因特异性PCR技术鉴定基因型
  • 2.1.4 计算抗性等位基因频率
  • 2代法检测田间抗性等位基因频率'>2.2 F2代法检测田间抗性等位基因频率
  • 2.3 区分（诊断）剂量法检测田间抗性
  • 2.4 剂量-反应法检测田间抗性
  • 3 讨论
  • 全文主要结论
  • 参考文献
  • 致谢
  • 攻读博士学位期间发表的学术论文

    • 相关论文文献

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