钩藤生物总碱对耐药惊厥大鼠脑内P-gp基因表达的影响

论文摘要

目的建立电刺激皮层点燃的新型耐苯妥英钠大鼠惊厥模型,研究钩藤生物总碱对耐药惊厥动物模型的对抗作用。同时观察耐药惊厥大鼠脑内电刺激损伤区P—糖蛋白（P—gp）基因表达变化,探讨钩藤生物总碱的抗耐药机制。并了解皮层损伤、苯妥英钠和长期惊厥发作三因素与模型大鼠脑内P-糖蛋白基因mdr1表达的关系。方法采用大鼠皮层放置微电极电刺激大鼠皮层点燃的方法制备惊厥模型。通过连续7天灌胃惊厥大鼠苯妥英钠(154mg·kg-1·d)并在每次药后电刺激皮层点燃发作制备耐苯妥英钠的大鼠惊厥模型。以维拉帕米为阳性对照药,灌胃两种剂量钩藤生物总碱后,观察药物对点燃耐药大鼠惊厥阈值和脑电变化的影响。运用RT-PCR方法检测实验大鼠脑内电刺激损伤区P-糖蛋白基因mdr1表达的量,通过统计学方法及统计软件对各样本目的基因扩增条带的灰度值（IOD）与内参基因GAPDH的IOD值的比值进行半定量分析。结果（1）惊厥模型制备:42只大鼠,除术后死亡2只,实验过程中电极脱落5只被弃除外,其余35鼠电刺激大脑皮层后,均产生Ⅰ—Ⅴ期发作,EEG出现明显的棘波或棘慢波,首次出现惊厥的平均惊厥阈值为1042.89±198.14,第14天平均惊厥阈值稳定在631.94±113.59水平,造模成功率为83.3%。（2）耐药惊厥模型制备:35只惊厥大鼠除电极脱落5只被弃除外,其余30鼠灌胃苯妥英钠。首次给药后,所有接受苯妥英钠处理大鼠的惊厥阈值均较惊厥模型对照组显著升高（P＜0.05）。连续接受苯妥英钠处理到第7天,惊厥阈值明显下降,与惊厥模型对照组比较无统计学差异,提示耐药惊厥模型制备成功,造模成功率达86%。（3）灌胃钩藤生物总碱(245mg·kg-1,490 mg·kg-1)和维拉帕米(38.5mg·kg-1)均使耐药惊厥大鼠的惊厥阈值明显增高,给药前后组内比较均有统计学差异（P＜0.05）,同时痫性放电较药前减轻。对各组大鼠用药前后惊厥阈值的差值进行组间比较结果表明,惊厥模型组与耐苯妥英钠惊厥模型组间无统计学差异;三个用药组的惊厥阈值增高值均分别大于惊厥模型组和耐苯妥英钠惊厥模型组,且具有统计学差异（P＜0.05）。其中钩藤生物总碱大剂量组阈值增高值最大,分别与维拉帕米和钩藤生物总碱小剂量组相比,均有显著性差异（P＜0.01）。但维拉帕米组和钩藤生物总碱小剂量组相比,无统计学差异。（4）半定量分析各组大鼠脑内P—gp检测结果表明,惊厥模型组大鼠的mdr1表达量虽然比正常对照组在数值上增高,但组间没有统计学差异;耐苯妥英钠惊厥模型组大鼠的mdr1表达量比惊厥模型组明显增高,统计学上具有显著性差异（P＜0.01）。钩藤生物总碱大剂量、小剂量组大鼠的mdr1表达量均低于耐苯妥英钠惊厥模型组,有统计学差异（P分别＜0.01）;维拉帕米组mdr1表达量亦较耐苯妥英钠惊厥模型组低,与耐苯妥英钠惊厥模型组间有显著统计学差异（P＜0.01）。结论（1）电刺激大鼠皮层运动区,大鼠出现恒定的部分发作——继发全身性发作和典型的痫性放电,点燃147,惊厥大鼠的惊厥阈值趋于稳定,造模成功率为83.3%。连续电刺激21天,灌胃苯妥英钠7天,惊厥大鼠对苯妥英钠产生耐受,耐苯妥英钠惊厥模型的造模成功率达86%。该模型作为新型耐药惊厥动物模型用于探讨难治性癫痫的作用机制和抗耐药制剂的筛选研究具有推广使用价值。（2）苯妥英钠可显著诱导P—gp基因mdr1的表达,而长期惊厥发作和脑损伤对P—gp基因mdr1的表达都有一定的诱导作用。电刺激大鼠皮层点燃的耐苯妥英钠惊厥模型产生耐药机制与药物、长期惊厥发作和脑损伤三因素协同诱导P—gp基因mdr1表达增加有关。（3）两种剂量钩藤生物总碱灌胃,对耐苯妥英钠惊厥大鼠惊厥发作均有对抗作用,其作用性质与维拉帕米相似。维拉帕米对耐苯妥英钠惊厥大鼠惊厥发作亦具有对抗作用,但抗惊厥效应较钩藤生物总碱的大剂量给药时弱。（4）两种剂量钩藤生物总碱均可抑制耐药惊厥大鼠脑内mdr1表达,其抗耐药机制与其抑制耐药惊厥大鼠脑内P—gp基因mdr1的表达有关。维拉帕米的抗耐药机制亦与其抑制耐药惊厥大鼠脑内P—gp基因mdr1的表达有关,且作用较钩藤生物总碱强。（5）钩藤生物总碱作为P—gp抑制剂,有望成为难治性癫痫的有效辅助治疗药物。

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