酿酒酵母菌和白念珠菌中RCK2和HOG1蛋白激酶在高渗胁迫，氧化胁迫和细胞壁完整性方面的功能研究

论文摘要

酿酒酵母ScRck2p是一种MAP Knase激活的蛋白激酶,被Hog1p磷酸化而激活,响应于细胞对外界高渗透压胁迫和氧化胁迫。在本工作中我们发现酿酒酵母ScRCK2基因的缺失能够导致细胞对TOR抑制剂——雷帕霉素敏感,但ScRCK2在细胞对雷帕霉素敏感过程中的作用并不依赖于其激酶活性。在人体内最常见的机会致病菌-白念珠菌中,我们鉴定了ScRCK2的同源基因CaRCK2,并发现CaRCK2基因的缺失同样导致白念珠菌细胞对雷帕霉素敏感,CaRck2p的这一作用同样不依赖于其激酶活性。此外,我们发现白念珠菌CaHOG1的缺失也导致细胞对雷帕霉素的敏感。这些结果表明在酿酒酵母菌和白念珠菌中,作用于HOG途径下游的RCK2可能调控TOR信号途径的功能。同时,我们发现白念珠菌CaRCK2基因的缺失能够导致细胞对高渗胁迫、氧化胁迫和细胞壁完整性胁迫试剂敏感。比较而言,酿酒酵母ScRCK2基因的缺失只引起细胞对氧化胁迫敏感,而不影响细胞对高渗胁迫和细胞壁完整性胁迫试剂的敏感。但是,酿酒酵母ScRCK2基因却能够弥补白念珠菌CaRCK2基因缺失株对高渗胁迫、氧化胁迫和细胞壁完整性胁迫试剂的敏感性表型。这些结果说明RCK2在细胞内发挥多种功能,但在白念珠菌和酿酒酵母菌中的功能存在分歧。我们还发现,ScRCK2上游激酶基因ScHOG1和ScPBS2的缺失,以及受ScHOG1调控的转录因子基因ScHOT1,ScMSN1,ScMSN2,ScMSN4或ScRLM1的缺失,不影响酵母细胞对雷帕霉素的敏感性。但是,白念珠菌CaHOG1基因的缺失能够导致细胞对雷帕霉素敏感。这些结果表明白念珠菌HOG途径与酿酒酵母HOG途径在细胞功能调控方面存在分歧,它参与细胞对雷帕霉素敏感性的调控。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 第一章 文献综述
• 1.1 酿酒酵母和白念珠菌HOG MAPK 信号转导途径简介
• 1.1.1 酿酒酵母HOG 信号转导途径的组成及调控
• 1.1.2 白念珠菌HOG 途径与酿酒酵母HOG 途径的差异
• 1.2 酿酒酵母TOR 途径简介
• 1.2.1 TOR 复合物的组成
• 1.2.2 TOR 对细胞生长的调控
• 1.2.3 TOR 对蛋白质合成和稳定性的调控
• 1.2.4 TOR 对转录的调控
• 1.3 酿酒酵母ScRCK2 基因研究进展
• 1.4 本论文的研究内容与意义
• 第二章 材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 质粒
• 2.1.3 主要实验仪器
• 2.1.4 培养基
• 2.1.5 试剂
• 2.1.6 常用溶液与缓冲液
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 大肠杆菌和酵母菌的培养与菌种保存
• 2 法制备感受态细胞'>2.2.2 CaCl₂法制备感受态细胞
• 2.2.3 质粒转化E.coli 感受态细胞
• 2.2.4 SDS 碱裂解法小量制备质粒DNA
• 2.2.5 SDS 碱裂解法大量制备质粒DNA
• 2.2.6 玻璃珠法提取酵母基因组DNA
• 2.2.7 液氮法提取酵母基因组DNA
• 2.2.8 PCR 扩增DNA 片断
• 2.2.9 乙醇沉淀法纯化DNA 片断
• 2.2.10 DNA 片断的柱纯化
• 2.2.11 酶切
• 2.2.12 连接
• 2.2.13 α互补筛选阳性克隆实验
• 2.2.14 乙酸锂法转化酿酒酵母细胞
• 2.2.15 乙酸锂法转化白念珠菌细胞
• 2.2.16 梯度连续稀释实验
• 2.2.17 网络共享资源简介
• 第三章 ScRCK2 基因在细胞对雷帕霉素敏感性中的作用
• 3.1 酿酒酵母ScRCK2 基因的缺失导致细胞对雷帕霉素敏感
• 3.2 ScRCK2 突变体在酿酒酵母细胞对雷帕霉素敏感性中的作用
• 3.3 小结与讨论
• 第四章 白念珠菌CaRCK2 基因的克隆与鉴定
• 4.1 白念珠菌CaRCK2 基因的克隆与激酶缺陷突变体CaRCK2KD 的构建
• 4.1.1 白念珠菌CaRCK2 基因的生物信息学分析
• 4.1.2 白念珠菌CaRCK2 基因的克隆
• 4.1.3 白念珠菌CaRCK2 基因激酶缺陷突变体CaRCK2KD 的构建
• 4.1.4 质粒pCR4-CaRCK2 和pCR4-CaRCK2KD 的构建
• 4.2 白念珠菌CaRCK2 基因可以互补酿酒酵母ScRCK2 基因的功能
• 4.3 过量表达CaRCK2 和CaRCK2KD 对酿酒酵母rck2Δ抗氧化胁迫能力的影响
• 4.4 小结与讨论
• 第五章 白念珠菌CaRCK2 基因的敲除与功能研究
• 5.1 CaRCK2 基因敲除盒的构建
• 5.2 白念珠菌CaRCK2 基因的敲除
• 5.3 CaRCK2 基因缺失株的功能研究
• 5.3.1 CaRCK2 基因的缺失导致白念珠菌细胞生长缓慢
• 5.3.2 CaRCK2 基因的缺失导致白念珠菌细胞对雷帕霉素敏感
• 5.3.3 CaRCK2 基因与白念珠菌细胞对氧化胁迫反应有关
• 5.3.4 CaRCK2 基因的缺失导致白念珠菌细胞对高渗胁迫敏感
• 5.3.5 CaRCK2 基因的缺失导致白念珠菌细胞对LiCl 敏感
• 5.3.6 CaRCK2 基因的缺失导致白念珠菌细胞对SDS，CFW 和CongoRed 敏感
• 5.4 酿酒酵母ScRCK2 对白念珠菌CaRCK2 的功能互补情况
• 5.4.1 酿酒酵母ScRCK2 基因和激酶缺陷突变体ScRCK2KD 的亚克隆
• 5.4.2 酿酒酵母ScRCK2 基因对白念珠菌CaRCK2 基因的功能互补
• 5.5 小结与讨论
• 第六章 酿酒酵母和白念珠菌HOG 途径在雷帕霉素敏感性中的作用
• 6.1 酿酒酵母HOG 途径与细胞雷帕霉素敏感性之间的关系
• 6.2 白念珠菌HOG 途径与细胞雷帕霉素敏感性之间的关系
• 6.3 白念珠菌CaHOG1 基因缺失株新表型的发现
• 6.4 小结与讨论
• 参考文献
• 发表论文和科研情况说明
• 致谢