5-氮胞苷体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化的研究

论文摘要

近年来随着我国人民物质生活水平提高及饮食结构的改变,缺血性心脏病（ischemic heart disease）在我国的发病率增长迅速。这是一种由于心肌的供氧和氧耗失衡引起心肌细胞坏死或变性的心脏病。成熟心肌无再生能力,心肌细胞缺氧死亡引起纤维组织增生修复、瘢痕形成,导致心室重塑（ventricular remodeling）、心功能下降,最终导致心功能衰竭（congestive heart failure）。目前对缺血性心脏病的治疗有药物治疗、介入治疗、外科血运重建、激光治疗等。这些治疗措施旨在改善局部血供,增强尚存心肌功能,挽救尚未死亡的心肌细胞,而对已经死亡的心肌细胞无任何作用。这一特点决定了这些治疗措施都是非根本性的。近年来,干细胞研究取得了令人瞩目的成就,干细胞分离纯化、体外扩增、诱导等技术日趋成熟。同时细胞治疗（cellular therapy）这一概念也进入我们的视野。细胞治疗是指通过移植功能细胞,修复、替代受损组织、器官的功能,已成为我们治疗组织坏死性疾病的一个崭新思路。通过将多种来源的干细胞（胚胎干细胞、骨骼肌卫星细胞、骨髓间充质干细胞等）进行自体心肌内移植,修复替代受损心肌是近年来心血管病研究的一大热点。本课题通过研究体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌细胞分化,探讨其体外分离、纯化的方法、体外培养MSCs的生物学特性、适宜的诱导剂浓度、诱导后的鉴定方法等,为MSCs在临床的应用提供理论依据。目的探讨体外使用5-氮胞苷诱导大鼠骨髓间充质干细胞（mesenchymal stem cells,MSCs）向心肌细胞分化,为缺血性心脏病细胞治疗提供种子细胞。材料与方法1.实验材料SD大鼠,4周龄,由河南省实验动物中心提供。2.方法：（1）无菌条件下获取SD大鼠股骨,差速贴壁法体外分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞。细胞培养使用含10%胎牛血清的LG-DMEM,细胞增殖铺满培养瓶底面约80%时消化传代。通过形态学方法与流式细胞仪检测细胞表面抗原表达的方法对体外培养的MSCs进行鉴定。（2）体外使用0、5、10、20μmol/L的5-氮胞苷对P3代MSCs诱导24小时,后改用含5%胎牛血清的LG-DMEM培养。（3）培养至第25天时,将MSCs接种到24孔板,含5%胎牛血清的LG-DMEM培养。（4）培养至第28天,免疫细胞化学方法检测心肌肌钙蛋白I（cardiac troponin I,cTnI）。（5）计算cTnl阳性率。数据采用x±sd表示,使用SPSS13.0统计软件分析。多样本均数间比较采用单因素方差分析,组间多重比较采用LSD-t检验,检验水准为a=0.05。结果（1）利用差速贴壁法分离纯化的MSCs,细胞大小均匀,增殖旺盛。台盼蓝染色示细胞活率>96%。流式细胞仪鉴定结果：分离纯化的MSCs高表达骨髓间充质干细胞表面标志CD90（98.7%）、CD44（98.5%）,而造血干细胞标志CD34（2.5%）、CD45（3.7%）均为阴性。（2）5-氮胞苷诱导后24h后,可见部分细胞死亡。1周时,少数细胞体积变大,呈长梭形。诱导2周时,可见部分细胞呈短柱状、多角状,细胞间接触紧密。诱导4周时,细胞大小不一,胞浆粗糙。未见诱导细胞有搏动。（3）10μmol/L组和20μmol/L组的诱导转化率之间无显著差异（P=0.639）,均明显高于5μmol/L组。结论（1）差速贴壁法分离纯化大鼠骨髓间充质干细胞,方法简便,分离纯度较高。（2）含10%胎牛血清的LG-DMEM适合大鼠骨髓间充质干细胞的体外培养。（3）5-Aza可以体外诱导大鼠骨髓间充质干细胞向心肌样细胞分化,心肌样细胞表达心肌特异蛋白。（4） 10μmol/L的5-Aza诱导MSCs,浓度适宜,效果较好。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 引言
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 骨髓间充质干细胞移植与缺血性心脏病研究进展
• 一、缺血性心脏病概述
• 二、骨髓间充质干细胞
• 三、骨髓间充质干细胞向心肌细胞诱导分化
• 四、大鼠MSCs诱导后的鉴定
• 五、干细胞移植改善心脏功能的可能作用机制
• 六、现存的问题及展望
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 在校期间发表的论文