论文摘要
未致敏CD4+T细胞在外周淋巴组织中接触到病原体抗原后,可分化成Th1和Th2两大类CD4+效应T细胞。Th1细胞主要分泌IL-2、IFN-γ和TNF-β等细胞因子,参与细胞毒性T细胞（CTL）介导的细胞免疫,主要在抗细胞内感染（如病毒感染、结核分枝杆菌感染等）中发挥重要作用;而Th2细胞主要分泌IL-4、IL-5、IL-6、IL-10及IL-13等细胞因子,其功能主要在于刺激B细胞增殖及嗜酸性粒细胞活化,促进抗体（IgG1与IgE）产生,参与体液免疫,在抗细胞外感染与致敏原引起的免疫应答中起主要作用。血吸虫病是典型的在不同感染阶段具有Th1、Th2免疫应答优势发生漂移与极化现象的慢性感染。在血吸虫感染过程中,宿主免疫应答大致可以划分成三个阶段。以小鼠感染模型为例,感染日本血吸虫后,在感染约21～25天（3～3.5周）,免疫应答以Th1型为主,主要由尾蚴、童虫及成虫等非虫卵抗原诱导产生。从26～28天（3.5～4周）左右起始,成虫开始产卵,35天（5周）左右体内细胞因子内环境出现转变,即从Th1优势应答逐渐向Th2优势应答偏移。至56天（8周）后,体内则明显转变为由虫卵抗原诱导的Th2优势应答。感染约91天（13周）,感染进入慢性期,此时Th1、Th2免疫应答均维持于不太高的平台期,但仍以Th2型免疫应答占优势。许多因素影响着Th1/Th2应答的极化方向,包括:抗原的剂量及形式、抗原肽与TCR的亲和性、抗原递呈细胞（APC）的类型、共刺激分子及细胞因子的影响等。近年来已有研究发现Th1、Th2细胞对TCR诱导的细胞凋亡（TCR-ICD）的敏感性不同,但是对病原体的不同抗原在感染不同阶段通过诱导不同的Th细胞凋亡从而影响Th1/Th2极化的研究则几乎没有。在本研究中,我们首先建立了血吸虫感染组小鼠（感染鼠体肉有非虫卵及虫卵抗原）及感染合并青蒿琥酯（Artesunate）化疗组小鼠（使感染鼠体内不含有虫卵抗原）模型,应用流式细胞仪,动态观察了感染后23、35、56天小鼠Th1、Th2细胞内凋亡关键分子caspase-3水平的变化,随后检测了SWA、SEA免疫小鼠的Th1、Th2细胞内caspase-3水平以及正常CD4+T细胞体外SWA、SEA刺激后产IFN-γ及IL-4细胞内caspase-3水平的变化,最后在SWA、SEA免疫小鼠后,用SWA、SEA体外再刺激小鼠单个核淋巴细胞同时加入caspase或GrB的抑制剂,并用TUNEL法检测Th1、Th2细胞凋亡情况。本研究获得如下主要结果:1.在自然感染过程中,感染23天小鼠体内呈现Th1类优势应答,此时Th2细胞的凋亡比例（10.16%）明显高于Th1细胞（6.77%）。感染35天,血吸虫成虫已经产卵,小鼠体内细胞因子内环境正出现一个转变过程,在Th1、Th2应答都增强的同时,从Th1优势应答逐渐向Th2优势应答偏移（即Th2类细胞因子逐渐增加并超过Th1类细胞因子）,此时,小鼠体内Th1细胞凋亡比例增加（7.60%）,然而Th2细胞凋亡比例减少（5.95%）。至感染56天,小鼠体内免疫应答主要是虫卵抗原诱导的Th2型免疫应答,此时Th1凋亡比例继续增加（9.66%）,而Th2细胞凋亡比例与感染35天时未有明显变化（6.18%）。感染合并化疗后23天小鼠也以Th1类免疫应答为主,此时体内Th2细胞凋亡比例（11.72%）明显高于Th1细胞凋亡（6.89%）,与感染23天小鼠结果一致。感染35天小鼠体内存在虫卵抗原,而感染合并化疗35天小鼠体内无虫卵抗原,此时体内Th1细胞凋亡比例,感染组小鼠（7.60%）比感染合并化疗组小鼠（4.58%）高,而Th2细胞凋亡比例,感染组（5.95%）比感染合并化疗组（11.70%）低。随着感染时间延长,感染56天时免疫应答主要表现为虫卵抗原诱导的Th2优势应答,此时,感染组小鼠Th1细胞凋亡比例（9.66%）与感染合并化疗组小鼠（5.61%）相比,提示前者在体内能够更强地诱导Th1细胞凋亡。由此推测,日本血吸虫感染早期,非虫卵抗原可能优势诱导Th2细胞凋亡,从而更有利于Th1极化的形成;成虫产卵后,虫卵抗原可能通过优势诱导Th1细胞凋亡,从而更有利于Th2极化的形成。血吸虫自然感染后结合SWA、SEA体外抗原刺激,这一现象则更明显:感染23天的Th细胞,SWA体外刺激后,Th2细胞凋亡比例（17.69%）明显高于Th1细胞（13.33%）。而感染合并化疗组23天时,Th2细胞凋亡比例（19.41%）也明显高于Th1细胞凋亡（12.88%）。感染35天血吸虫产卵后,加用SEA体外刺激,Th2细胞凋亡比例（14.79%）仍稍高于Th1细胞（12.24%）。而感染56天,结合体外SEA刺激后,Th1细胞凋亡比例（14.78%）明显高于Th2细胞凋亡比例（10.41%）。体外加用SEA抗原刺激后,感染组与感染合并化疗组相比,感染35天体内Th1细胞凋亡比例（12.24%）明显高于感染合并化疗组Th1细胞凋亡比例（7.58%）;而感染合并化疗35天Th2凋亡比例（15.73%）则略高于感染组Th2细胞凋亡比例（14.79%）。感染56天小鼠体内Th1凋亡比例（14.78%）与感染合并化疗组Th1凋亡比例（6.80%）相比,则增高得更明显;而Th2细胞凋亡比例（10.41%）则低于感染合并化疗组Th2凋亡比例（13.51%）。为进一步佐证非虫卵抗原与虫卵抗原诱导Th1/Th2凋亡的倾向性,我们分别用SWA,SEA免疫正常小鼠,观察到,SWA免疫的小鼠,Th2细胞凋亡比例（12.27%）明显高于Th1细胞凋亡比例（6.64%）;而SEA免疫的小鼠,Th1细胞凋亡比例（8.34%）明显高于Th2细胞凋亡比例（6.99%）我们又用磁珠分选出正常小鼠的cD4+T细胞,用SWA,sEA分别进行体外刺激,检测两种细胞凋亡情况,类似地,这个实验同样也支持了我们的观点。2.我们用SWA、SEA分别刺激SWA或SEA免疫小鼠后的单个核淋巴细胞后,再分别加入GrB抑制剂Z-AAD-CMK或caspase抑制剂Z-VAD-FMK,随后用TUNEL法检测Th1、Th2细胞凋亡。结果显示,SWAP诱导的Th2凋亡可部分被GrB抑制剂阻断,SEA诱导的Th1凋亡可部分被caspase抑制剂阻断。可见在血吸虫感染过程中不同抗原诱导不同Th细胞的凋亡可能也与其分别优先激活Th1、Th2细胞中不同的凋亡通路相关。综上所述,本研究中我们发现,血吸虫感染过程中,感染早期,非虫卵抗原似乎更多地诱导Th2细胞凋亡从而有利于Th1极化的形成;产卵后,虫卵抗原可能更易于诱导Th1细胞凋亡,从而有利于Th2极化的形成。我们还探讨了这一现象可能存在的机制,非虫卵抗原可能是通过GrB凋亡途径优势诱导Th2细胞凋亡从而参与对Th1极化的影响;而虫卵抗原可能是通过caspase凋亡途径优势诱导Th1细胞凋亡从而参与对Th2极化的影响。以上结果提示,病原体在感染的不同阶段可能以不同的优势抗原来倾向性地诱导Th1/Th2细胞的凋亡,从而有利于实现Th1/Th2类型转换、以实现其免疫逃避和感染的慢性化。