论文摘要
近年来,前列腺癌的发病率及死亡率逐年增高,由于前列腺癌发病隐匿,早期缺乏临床症状,诊断时多为中晚期。临床上对于中晚期前列腺癌的治疗方法以雄激素阻断为主,但很多患者可由雄激素依赖性前列腺癌发展到雄激素非依赖性阶段,使抗雄激素治疗达不到效果,并导致其较高的转移率及临床中的难治性。因此,研发新的抗肿瘤药物以延缓或阻止晚期前列腺癌进展成为当前迫切的需要。目前有关植物和食物的有效活性成分用来预防或治疗前列腺癌的研究逐年增多,旨在寻找新的植物性化疗药物,能选择性地抑制肿瘤细胞的增殖和/或诱导肿瘤细胞的凋亡,而对正常细胞没有杀伤作用。欧亚旋覆花属菊科植物,具有消痰、行水、降气、止呕、软坚之功效。研究表明,旋覆花花头部分含有丰富的倍半萜内酯化合物大花旋覆花内酯（1-O-acetylbritannilactone,ABL）,其具有抗炎、抗肿瘤的作用。我们用二氧化碳超临界萃取法从欧亚旋覆花中提取得到ABL,但是该单体化合物抑制肿瘤细胞生长和诱导细胞凋亡的作用较弱。因此,我们通过拼合合成方法,对ABL的6-OH进行了修饰得到6-O-（α-甲基-6-甲氧基-2-萘乙酰基）旋覆花内酯（ABL-N）。初步的药理学研究表明,ABL-N对多种肿瘤细胞株的生长具有强抑制效应,又证实该化合物具有较高的安全性。因此,我们认为ABL-N是一种具有应用前景的、新的抗肿瘤目标化合物。然而,ABL-N对前列腺癌细胞作用如何,及其在体内的抗肿瘤作用机制、作用靶点和作用途径为何,尚需进一步研究。为此,本研究以前列腺癌细胞为研究对象,探讨ABL-N对前列腺癌细胞的抗增殖、促凋亡的作用并研究其作用机制,为前列腺癌的发病机制提供新的实验和理论依据,为前列腺癌提供新的治疗方法。实验内容主要包括以下三部分:第一部分:ABL-N抑制前列腺癌细胞增殖、促进凋亡的研究。目的:探讨ABL-N对前列腺癌细胞增殖、凋亡的影响。方法:本部分实验中我们选取雄激素依赖性细胞LNcap、雄激素非依赖性细胞DU145、PC3及前列腺上皮细胞PrEC作为研究对象,通过MTT、TUNEL/DAPI染色、Annexin V/PI染色、细胞凋亡ELISA法等方法检测ABL-N作用后,前列腺癌细胞的增殖和凋亡变化,并通过伤口愈合实验检测其对细胞迁移的作用。结果:1 ABL-N作用后PC3,Du145和LNCap细胞的活力变化MTT实验证明,PC3,Du145和LNCap细胞在不同浓度（0、2.5、5、10、15、20、25、30、35、40μmol/L）的ABL-N培养24h后,细胞活力随ABL-N浓度的增加而降低,呈剂量依赖性,而PrEC的细胞活力受到的影响很小,40μmol/L ABL-N作用24h后,PrEC细胞存活率为（73.34±4.41）%,而三种前列腺癌细胞存活率分别为（11.92±2.31）%、（12.55±1.94）%、（13.28±2.26）%。三种细胞的半数有效抑制浓度（IC50）相近,分别为（13.65±1.45）μmol/L、（16.92±1.91）μmol/L、（17.01±1.73）μmol/L。根据MTT实验结果,分别选取ABL-N浓度为0、5、10、20、40μmol/L作为作用终浓度,PC3细胞作为研究对象进一步实验研究。2 ABL-N作用后PC3细胞凋亡改变PC3在不同浓度ABL-N （0、5、10、20、40μmol/L）作用24h后,经TUNEL/ DAPI染色所示,TUNEL染色深度随着ABL-N浓度的增加而增加,DAPI染色随ABL-N浓度的增加逐渐出现核固缩、核碎裂。细胞凋亡ELISA法检测所示随ABL-N浓度的增加DNA碎片明显增加。ABL-N作用后的PC3细胞经流式细胞仪测定显示,通过凋亡标志物Annexin V/PI染色,四个象限分别为Q1坏死细胞,Q2中晚期调亡细胞,Q3正常细胞,Q4早期调亡细胞。随ABL-N的浓度的增加,Q3象限的细胞逐渐减少,并逐渐向Q4、Q2、Q1象限过度,调亡细胞数目明显增多。对照组细胞中annexin V阳性而PI阴性的细胞（早期凋亡）占（0.5±0.12）%,而20μmol/L ABL-N作用后早期凋亡细胞约占（25±1.16）%,annexin V/ PI阳性细胞（晚期凋亡）在20μmol/L、40μmol/L ABL-N分别约为（28±1.64）%和（50±1.98）%。3 ABL-N对细胞迁移的影响通过伤口愈合实验结果显示,随ABL-N浓度的增加,PC3细胞的迁移力明显下降,ABL-N （20μmol/L）可明显抑制PC3细胞迁移活性,较对照组下降了约90 %。结论:ABL-N可以诱导前列腺癌细胞凋亡、抑制其增殖,同时抑制前列腺癌细胞的迁移活性。第二部分:ABL-N抑制前列腺癌细胞增殖和促进调亡的机制研究目的:探讨ABL-N对前列腺癌细胞抑制增殖和促进调亡的可能作用机制,为旋覆花提取物作为抗肿瘤药物的临床应用提供实验依据。方法:PC3为雄激素非依赖性前列腺癌细胞,因其具有较高侵袭性及转移性,因此本部分实验以PC3作为研究对象,并选取Caspase凋亡途径、凋亡相关基因Bax、Bcl-2和与肿瘤的生长、侵袭性相关蛋白Klf5、Stat5b、ICAM-1作为研究目标,进一步探讨ABL-N诱导前列腺癌细胞凋亡的作用机制。结果:1 ABL-N对前列腺癌相关蛋白Klf5,Stat5b,ICAM-1表达的影响为了进一步阐明ABL-N的诱导前列腺癌细胞凋亡的作用机制,我们选取了与前列腺癌相关的蛋白Klf5,Stat5b。实验结果表明,随ABL-N浓度的增加,Klf5,Stat5b蛋白表达明显下降（P<0.05）,呈剂量依赖性,20μmol/L浓度作用24小时后,Klf5蛋白表达量（0.87）较对照组（1.79）下降了（51.54±4.53）% , Stat5b蛋白表达量（0.57）较对照组（1.23）下降了（53.12±4.31）%。同时我们评价了与前列腺癌转移活性相关蛋白ICAM-1的表达变化,实验结果表明, ABL-N抑制了ICAM-1的蛋白表达（P<0.05）,呈剂量依赖性,20μmol/L浓度作用24小时后,蛋白表达量（0.63）较对照组（1.95）下降了（67.75±4.88）%。2 ABL-N对Bcl-2家族成员的表达影响实验结果表明,ABL-N作用后,随着其浓度的增加,Bax的表达明显增加（P<0.05）,呈剂量依赖性,20μmol/L浓度作用24小时后,蛋白表达量较对照组增加了（91.49±6.38）%。而Bcl-2,Bcl-xl的水平变化不明显,Bax/ Bcl-2比率随剂量增加明显增高（P<0.05）,呈剂量依赖性,20μmol/L ABL-N作用24h后,Bax/ Bcl-2比率（1.18）是对照组活性（0.57）的约2倍。3 ABL-N对Caspase家族成员的表达影响为了进一步探索Caspase途径是否参与ABL-N促进前列腺癌凋亡的过程,色度法检测了caspase-2, caspase -3, caspase-6, caspase-8和caspase-9的活性变化。结果表明,caspase-3的活性随ABL-N浓度的增加明显增高,ABL-N 20μmol/L作用24h后其活性（0.95）是对照组活性（0.24）的4.23倍（P<0.05）。同时caspase-9,caspase-2, caspase -6和caspase -8的活性也有不同程度增高。4 Caspase抑制剂对ABL-N促凋亡作用的影响为了进一步阐明Caspase途径在ABL-N诱导前列腺癌凋亡过程中的作用,我们分别应用了总Caspase抑制剂Z-VAD-fmk及Caspase3特异性抑制剂z-DEVD-fmk,实验结果显示,通过DNA凋亡碎片检测表明,预使用Z-VAD-fmk（50μmol/L）作用后,ABL-N（20μmol/L）作用24小时后,DNA凋亡碎片明显下降约66.04% （P<0.05）。而预使用z-DEVD-fmk （50μmol/L）作用后,ABL-N（20μmol/L）作用24小时后,DNA凋亡碎片明显下降约54.38% （P<0.05）。为了进一步证明ABL-N诱导PC3细胞凋亡是否通过直接激活Caspase3起作用,预使用z-DEVD-fmk（50μmol/L）作用4小时后,之后用ABL-N（20μmol/L）作用24小时后,实验结果表明,Caspase3活性明显下降约65.77%,（P<0.05）。结论:ABL-N通过抑制肿瘤相关因子Klf5,Stat5b,ICAM-1的表达,促进促凋亡基因Bax高表达,提高Bax/Bcl-2的比率,并通过线粒体途径诱导前列腺癌细胞凋亡来发挥抗肿瘤作用,并抑制其侵袭作用。第三部分:ABL-N对前列腺癌裸鼠种植瘤的抑制作用及对种植瘤相关蛋白表达的影响目的:通过体内实验进一步探讨ABL-N对前列腺癌裸鼠种植瘤的抑制作用及对种植瘤相关蛋白表达的影响。方法:体外实验表明ABL-N能够明显诱导前列腺癌细胞凋亡,抑制细胞的生长,呈剂量依赖性。为了进一步研究是否对前列腺癌肿瘤起到抑制生长的作用,我们进行了体内实验,成功建立了前列腺癌种植瘤模型。通过观察肿瘤的体积及体重等状态变化,进一步检测ABL-N对前列腺癌种植瘤的体内抑癌作用。并通过免疫组化方法检测肿瘤相关蛋白Klf5、Stat5、ICAM-1、Bax、Bcl-2在种植瘤内整体水平表达的影响。结果:1 ABL-N抑制前列腺癌种植瘤的生长。为了进一步研究ABL-N对前列腺癌肿瘤的抑制作用,我们进行了体内实验,成功建立了前列腺癌PC3种植瘤模型。ABL-N腹腔注射治疗裸鼠后,其肿瘤与对照组相比生长速度明显减慢,实验16天后,治疗组较对照组体积减小（P<0.05）,实验20天后肿瘤体积较对照组明显减小（P<0.01）,随天数的增多两者的差异日趋明显。实验32天后,ABL-N治疗组较对照组体积减小约（25.65±2.14）% （P<0.01）。2 ABL-N对荷瘤裸鼠的体重及一般情况影响为了进一步评估ABL-N的毒副作用,我们观察了荷瘤裸鼠的饮食、活动等一般情况,同时测量体重的变化,结果显示ABL-N治疗组与对照组裸鼠的饮食、活动等一般情况及体重无明显变化,两组无统计学差异（P>0.05）,同时免疫组化验证ABL-N治疗后的裸鼠肝肾组织无病理学变化。3 ABL-N对肿瘤Bcl-2家族蛋白表达的影响体外实验证明ABL-N能通过影响Bax、Bcl-2的表达水平及Bax/Bcl-2的比率促进前列腺癌细胞凋亡,我们进一步验证ABL-N对肿瘤中Bax、Bcl-2的表达水平的影响,免疫组化结果显示,ABL-N作用组较对照组能明显增加肿瘤中Bax蛋白的表达（P<0.05）,而Bcl-2的表达水平变化不明显,与体外实验的结果相似,结果表明ABL-N可能通过Bcl-2家族发挥抑癌的作用。4 ABL-N作用后肿瘤相关蛋白表达的影响体外实验证明ABL-N能够抑制或降低与肿瘤的发生、侵袭及转移相关蛋白Klf5、Stat5、ICAM-1的表达,我们体内实验进一步检测ABL-N对肿瘤中蛋白的表达水平变化,免疫组化结果显示,ABL-N作用组较对照组能明显降低肿瘤中Klf5、Stat5、ICAM-1蛋白的表达（P<0.05）。结果表明ABL-N可能通过抑制Klf5、Stat5、ICAM-1等相关蛋白的表达发挥抑癌的作用。结论:综上所述,在裸鼠种植瘤模型水平上证明ABL-N可以抑制肿瘤生长,其可以通过提高Bax蛋白的表达,提高Bax/Bcl-2的比率,抑制肿瘤生长、转移相关蛋白ICAM-1、Stat5、Klf5的表达,从而抑制前列腺癌的生长。