除草剂乙草胺降解菌株YCA1的分离、降解特性及应用研究

论文摘要

乙草胺是美国Monsanto公司于1971年研制成功的一种酰胺类除草剂,它具有杀草谱广、活性高、选择性强等特点,现已被许多国家广泛使用。乙草胺然是一种低毒除草剂,但其使用量大,也引起了一些环境问题,其中较为显著的是对后茬作物的药害问题。环境污染的微生物修复具有其他修复方法不可比拟的优势,如高效、无毒、无二次污染等,目前已成为去除农药污染残留的一种重要方法。本研究是分离筛选乙草胺高效降解菌株,并研究其降解特性及初步应用,以期为乙草胺污染土壤的修复提供材料与理论依据。采用驯化富集的方法,从被乙草胺长期污染的土壤样品中分离到一株乙草胺降解菌,命名为YCA1。经过其表型特征、生理生化特征和菌株16S rRNA基因序列的系统发育分析,将菌株YCA1鉴定为芽孢杆菌属（Bacillus sp.）。菌株YCA1在3d内对50 mg.L-1的乙草胺降解率为78.7%；不同环境因子中,温度、pH值、装液量和NaC1浓度对YCA1生长的影响不同,最适生长温度为30℃,最适pH值为7.0；装液量越大对菌株YCA1的生长越有利；NaC1浓度在10g·L-1时长势最好。菌株YCA1能很好的利用果糖和葡萄糖生长,但较难利用多糖；能够利用大多数常见氮源,其中以蛋白胨和酵母粉为最好。对于低浓度的乙草胺,YCA1能够高效降解,对于100mg·L-1以上浓度的乙草胺也可以降解,但是降解速度比较慢；加大接种量能提高降解率。菌株降解乙草胺的最适pH值为7.0,这与菌株的最适生长pH一致；菌株降解的最适温度为30℃,低于或者高于30℃时降解能力都会下降；YCA1的降解效果与装液量呈正相关,装液量大的情况下降解效果好。葡萄糖、蛋白胨等外加碳、氮源能促进YCA1对乙草胺的降解。同时运用HPLC和LC-MS的手段分析了菌株YCA1在以乙草胺为唯一碳源的无机盐培养基中降解乙草胺时产生的代谢产物,推测了菌株YCA1降解乙草胺的途径。对YCA1在灭菌和未灭菌土壤中降解乙草胺的情况进行了研究。未接种菌株YCA1的灭菌土中只有7.2%的乙草胺被降解,而在接种菌株YCA1的灭菌土中,有57.5%的乙草胺被降解。在未灭菌土壤的未接种和接种处理中,降解率分别是8.8%和64.5%,这说明YCA1与土著微生物联合作用要高于它们各自单独降解乙草胺的降解效率。YCA1降解土壤中乙草胺的效果与接种量、土壤含水量等土壤条件有很大关系：增加接种量可以促进YCAl对乙草胺的降解,适当的土壤含水量对菌株YCA1降解乙草胺也很重要。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号与缩略语说明
• 前言
• 文献综述
• 1 乙草胺的概况
• 1.1 乙草胺简介
• 1.2 乙草胺的理化性质
• 1.3 乙草胺的毒性
• 1.4 应用范围
• 1.5 除草机理
• 1.6 乙草胺对后茬作物的药害
• 2 乙草胺的环境行为
• 2.1 吸附
• 2.2 淋溶
• 2.3 光解
• 2.4 水解
• 2.5 微生物降解
• 3 污染土壤的生物修复研究概况
• 3.1 生物修复概念
• 3.2 生物修复的种类
• 3.2.1 原位生物修复
• 3.2.2 异位生物修复
• 3.3 影响修复的因素
• 3.3.1 微生物自身的影响
• 3.3.2 农药的影响
• 3.3.3 外界环境的影响
• 4 微生物修复的方式
• 4.1 矿化作用
• 4.2 共代谢作用
• 4.3 间接作用
• 5 微生物在环境修复中的作用与地位
• 参考文献
• 第一章 乙草胺降解菌的分离鉴定及生长特性的研究
• 第一节 乙草胺降解菌的分离鉴定
• 1 材料与方法
• 1.1 供试土壤、农药、试剂及仪器
• 1.1.1 供试土壤
• 1.1.2 供试农药及试剂
• 1.1.3 培养基及主要仪器
• 1.2 降解菌株的富集、筛选及纯化
• 1.3 乙草胺的检测方法
• 1.3.1 紫外扫描法
• 1.3.2 液相色谱法
• 1.4 降解菌株的培养特性及生理生化鉴定
• 1.5 乙草胺降解菌株16S rRNA基因序列的PCR扩增及测序
• 1.5.1 菌株基因组总DNA的提取
• 1.5.2 降解菌16S rRNA的PCR扩增
• 1.5.3 普通感受态细胞的制备和转化
• 1.5.4 质粒DNA的小量提取
• 1.5.5 PCR产物的T/A克隆
• 1.5.6 16S rRNA基因的序列测定
• 1.5.7 降解菌株的系统发育分析
• 2 结果与分析
• 2.1 草胺降解菌株的分离、纯化
• 2.2 降解菌株YCA1的菌落形态
• 2.3 菌株YCA1的基因组DNA的提取及16S rRNA基因的扩增
• 2.4 菌株YCA1的系统发育分析
• 第二节 乙草胺降解菌株YCAl的生长特性研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、试剂与培养基
• 1.2 菌种制备及菌体生长量的测定方法
• 1.3 生长曲线的绘制
• 1.4 不同环境条件对菌株YCA1生长的影响
• 1.4.1 温度对菌株YCA1生长的影响
• 1.4.2 培养基初始pH值对菌株YCA1生长的影响
• 1.4.3 装液量对菌株YCA1生长的影响
• 1.4.4 NaCl对菌株YCA1生长情况的影响
• 1.4.5 不同碳源对菌株YCA1生长的影响
• 1.4.6 不同氮源对菌株YCA1生长的影响
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株的生长曲线
• 2.2 温度对菌株YCA1生长情况的影响
• 2.3 培养基初始pH对菌株YCA1生长的影响
• 2.4 装液量对菌株YCA1生长的影响
• 2.5 NaCl浓度对菌株YCA1生长的影响
• 2.6 不同碳源对菌株YCA1生长的影响
• 2.7 不同氮源对菌株YCA1生长的影响
• 本章小结
• 参考文献
• 第二章 乙草胺降解菌YCA1的降解特性及其代谢途径的研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株、试剂和培养基
• 1.1.1 供试菌株
• 1.1.2 试剂
• 1.1.3 培养基
• 1.2 菌株的培养和接种
• 1.3 草胺及其代谢产物的检测方法
• 1.3.1 紫外检测及HPLC检测方法
• 1.3.2 HPLC-MS联机检测分析
• 1.4 菌株YCA1利用乙草胺的生长降解曲线
• 1.5 乙草胺起始浓度对菌株YCA1降解乙草胺的影响
• 1.6 环境因子对YCA1降解乙草胺的影响
• 1.6.1 温度对YCA1降解乙草胺的影响
• 1.6.2 初始pH值对YCA1降解乙草胺的影响
• 1.6.3 接种量对YCA1降解乙草胺的影响
• 1.6.4 装液量对YCA1降解乙草胺的影响
• 1.6.5 不同营养物质对YCA1降解乙草胺的影响
• 1.7 菌株YCA1降解乙草胺的代谢途径的初步研究
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株YCA1利用乙草胺的生长降解典线
• 2.2 草胺起始浓度对菌株YCAl降解乙草胺的影响
• 2.3 环境因子对YCA1降解乙草胺的影响
• 2.3.1 温度对YCA1降解乙草胺的影响
• 2.3.2 初始pH值对YCA1降解乙草胺的影响
• 2.3.3 接种量对YCA1降解乙草胺的影响
• 2.3.4 装液量对YCA1降解乙草胺的影响
• 2.3.5 不同营养物质对YCA1降解乙草胺的影响
• 2.4 菌株YCA1降解乙草胺的代谢途径的初步研究
• 2.4.1 代谢产物的HPLC-MS分析
• 2.4.2 代谢产物的定性分析
• 2.4.3 代谢途径的推测
• 3 本章小结
• 参考文献
• 第三章 乙草胺降解菌株YCA1用于乙草胺污染土壤的修复研究
• 1 材料与方法
• 1.1 菌株与培养基
• 1.2 供试农药与试剂
• 1.3 供试土壤与作物
• 1.4 菌种制备
• 1.5 土壤中乙草胺的提取及检测
• 1.6 土壤中乙草胺降解实验
• 1.7 土壤条件对土壤中乙草胺降解的影响
• 1.7.1 接种量对降解效果的影响
• 1.7.2 土壤含水量对降解效果的影响
• 1.7.3 YCA1对土壤中不同浓度乙草胺的降解效果
• 2 结果与分析
• 2.1 菌株YCA1在灭菌和不灭菌土壤中对乙草胺的降解
• 2.2 接种量对菌株YCA1降解土壤中乙草胺的影响
• 2.3 土壤含水量对菌株YCA1降解土壤乙草胺的影响
• 2.4 YCA1对土壤中不同浓度乙草胺的降解
• 3 本章小结
• 参考文献
• 全文总结
• 本论文主要创新点及不足
• 附录一 文中所用试剂配方
• 附录二 相关DNA序列
• 攻读硕士学位期间发表或已接受的学术论文
• 致谢