论文摘要
尸体化学研究尸体血液、脑脊液、玻璃体液（vitreous humour, VH）以及其它体液中化学成分的死后变化。玻璃体液具有解剖位置相对隔离、不易受到污染和死后变化、腐败缓慢等特点，是尸体化学研究的理想检材。死亡时间推断是法医病理学研究的首要任务之一，VH成分死后变化与PMI关系也成为国内外法医学研究的热点。近年来，研究重点集中到提高推断准确度上，包括取样方法、成分选择以及PMI推断方程建立方法等。本文重点探索VH微量取样方法及推断方程置信区间的作用，分述如下：第一部分微量取样VH的方法研究VH在尸体化学研究中占有重要位置。眼科生理学研究认为玻璃体内各部分物质含量不均一，即存在“浓度梯度”，Coe因此认为应一次取出所有VH以避免其影响样本物质含量。随着检验技术的提高，近年有学者提出了微量或部分取样VH。还有学者观察认为双眼VH物质含量也不一致，或死后改变不同步。上述争议影响了VH的取样和研究方法，未见取样方法专项研究报道。本部分采用动物实验，初步探讨样本物质含量与眼内浓度梯度和双眼浓度差的关系，比较微量取样与一次取样的差异，以及间隔取样的可行性及对PMI研究的影响。在法医学界首次研究了VH微量重复取样和间隔微量取样的可行性，为人体研究提供取样方法准备。实验1 VH钙、钾、钠、氯、磷含量与浓度差的研究目的研究VH样本钙、钾、钠、氯、磷含量与眼内“浓度梯度”的关系，以及双眼VH样本物质含量及其死后变化是否一致，研究重复微量取样的可行性以及是否存在双眼浓度差异。方法28只健康家兔随机分为3组：（1）组：家兔10只，按Coe提倡的方法，于PMI12h双眼分别一次取出所有VH；（2）组：动物9只，于PMI12h双眼分别微量取样50μl、连续取15次；（3）组：动物9只，于PMI120h双眼分别微量取样50μl、连续取15次。检测钙、氯、钾、钠离子和无机磷含量，各组双眼配对t检验，（2）、（3）组微量重复取样的方差分析及时间、左右眼分组两个分组因素的方差分析等。结果（2）、（3）组微量重复取样样本总体无差异（P＞0.05）；（1）、（2）、（3）组双眼组分含量无差异（P＞0.05）。结论死后VH双眼物质含量及死后变化一致；所谓玻璃液浓度梯度未显著影响微量重复取样样本的物质含量，微量重复取样样本总体一致。实验2微量取样与一次取样VH的比较研究目的比较微量取样与一次取样的差异，研究两种取样方法对样本物质含量的影响。方法健康家兔36只随即分为4组：①组于PMI12h双眼分别一次取出所有VH；②组于PMI12h双眼分别取样50μl、连续取15次；③组于PMI12h取样：右眼（同②组）取样50μl、连续取15次；左眼（同①组）一次取出所有VH；④组：于PMI12h双眼先后2次取样，先微量取样50μl（同②组），剩余VH一次取出（同①组）。检测钙、氯、钾、钠离子和无机磷等含量，统计分析各实验组（次）VH物质含量变异系数，③组双眼配对t检验比较两取样方法获得的样本均数。结果①组钙、氯、钾、钠离子和无机磷的变异系数为25.97％，17.87％，33.92％，21.58％和40.01％，较②组平均变异系数钙10.08％，氯4.76％，钾11.35％，钠5.30％，磷17.70％显著较高。③组左眼与右眼的平均变异系数为：钙24.62％和10.23％，氯20.83％和5.25％，钾37.64％和11.50％，钠22.53％和4.88％，磷41.08％和17.02％；左右眼配对t检验无差异（P＞0.05）。④组先后两次取样的变异系数为：钙9.73％和18.55％，氯4.20％和15.08％，钾10.16％和19.95％，钠4.46％和21.36％，磷17.71％和35.12％；第1次取样双眼浓度差与均数的平均比为2.122％～17.972％，第2次取样为15.091％～35.992％。结论一次取样与微量取样VH物质含量总体一致，但是取样方法对样本物质含量的离散度有影响。一次取样样本的变异程度和双眼间浓度差的弥散程度较大；微量取样的稳定性、可重复性较好，更适于VH死后研究。实验3间隔多次微量取样玻璃体液研究目的探索间隔多次微量取样的可行性，以及对PMI研究的影响。方法健康家兔99只分为7组，（1）至（6）组每组9只，（7）组45只。（1）至（5）组左眼为实验组，间隔12h、多次取样50μl，分别至死后24h、48h、72h、96h和120h；右眼为对照组，于死后24h、48h、72h、96h和120h取样50μl一次。检测钙、钾、钠、氯离子和无机磷含量，实验组与对照组按同一动物配对t检验。（6）组9只家兔，右眼于死后12h、36h、60h、84h、108h，左眼于死后24h、48h、72h、96h、120h分别取样50μl；（7）组45只动物（90眼）编号分为10组，于12h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h和120h取1组（10眼）取样50μl 1次。检测钙、钾和钠离子含量，（6）组与（7）组钙、钾和钠含量差值t检验及PMI回归方程的比较分析。结果（1）至（4）组配对t检验钙、钾、钠、氯离子和无机磷含量无差异（P＞0.05）；（5）组钾含量有差异（P=0.025），而钙、氯、钠离子和无机磷含量无差异（P＞0.05）。（6）组与（7）组组间钙、钾、钠离子含量差值t检验无差异（P＞0.05）。（6）组与（7）组钾、钠离子PMI回归方程的比较分析无差异（P＞0.05）；钙离子含量均与PMI无相关性。结论PMI96h内，间隔微量取样未显著影响VH钙、钾、钠、氯离子和无机磷等物质含量的死后变化；间隔时间、双眼交替微量取样对钙、钾和钠死后变化趋势无影响，可以替代传统一次取样方法成为玻璃体液PMI研究的取样方法之一。第二部分VH成分死后变化及角膜上皮基底细胞核DNA含量变化与PMI关系的研究推断死亡时间是VH研究的重要课题之一。迄今为止PMI推断方程不一、推断准确度不高。有学者提出对死因、年龄、温度等进行控制、VH多成分研究建立多元推断方程、以PMI为自变量建立推断方程等以提高推断准确度，部分国外学者还注意到了置信区间对总体推断结果的影响。本部分采用动物实验，运用第一部分的研究成果，间隔微量取样观察了VH钾、钠、镁、铵离子的死后变化；结合本系在检测DNA含量推断PMI研究领域的丰富经验，研究了排列规则、成分单一的角膜上皮基底细胞DNA含量相关7个参数的死后变化。从置信区间角度讨论各参数PMI推断价值，并在多指标、参数范围探讨多元拟合推断方程的意义。这项研究为国内PMI推断引入了评价新标准，为今后研究指标筛选和建立多元分析提供重要方法参考。实验4间隔取样VH检测钾、钠、镁、铵含量推断PMI研究目的双眼交替间隔取样、观察家兔VH钾、钠、镁和铵等离子含量死后变化，结合置信区间评估各参数的PMI推断价值。方法健康家兔12只，分为2组。实验组动物9只，双眼间隔12h、交替微量取样50μl至PMI96h。检测钾、钠、镁和铵离子含量，分析含量变化规律与PMI的关系，建立PMI推断方程、评估95％推测置信区间。测试组动物3只，于PMI12h～96h内随机选取实验时间12h，24h，60h，78h，84h和96h，取样50μl。检测钾、钠、镁和铵离子含量，测试实验组各参数推断方程的推测偏差。结果实验组钾、镁和铵离子随PMI增高，钠离子含量下降，死后变化均与PMI显著相关（P＜0.001），确定系数均在0.95以上。建立的PMI推断方程为：钾（X1）：Y1=12.038-1.272X1+0.123X12（r2=0.9970）；钠（X2）：Y2=438.346-3.177X2（r2=0.9864）；镁（X3）：Y3=259.158X3-53.455X32-216.430（r2=0.9388）；铵（X4）：Y4=0.072X4-40.827（r2=0.9566）。钠和镁方程的平均误差为15.25h和13.51h；钾和铵为8.897h和8.084h。钾推断方程平均95％置信区间约为±9h，但随PMI逐步增大，死后72h达±14h左右；而铵、镁、钠推测方程95％置信区间基本稳定，分别约为±6h，±13h和15h。检测组检测钾、镁、铵推导方程平均偏差分别为6.48h，7.13h和9.29h，而钠高达19.34h。结论死后96h内，VH钾、钠、镁、铵离子含量变化均与PMI相关，可建立推断方程。推断方程及其置信区间均与PMI推断准确度有关，评价方程时应考虑推断置信区间：钠、镁方程的95％置信区间为13h～15h，整体PMI价值偏低；钾95％置信区间随PMI逐步扩大，可能影响PMI72h以后的推测精度。综合考虑，72hPMI内，钾研究价值较高；而死后24h～96h内铵的研究价值较大。实验5角膜上皮基底细胞DNA含量以及VH钾、钠含量与PMI关系的研究目的运用图像分析技术，研究家兔角膜上皮基底细胞DNA含量变化与PMI的关系；并结合实验4观察结果，探索多元PMI推断方程对推断准确度的影响。方法健康家兔36只，单眼编号后随机分为12组（每组6目），分别于死后0h、6h、12h、24h、36h、48h、60h、72h、84h、96h、108h、120h分组取材固定，切片Feulgen染色，利用图像分析技术检测角膜上皮基底细胞核DNA面积（A）、等效直径（MD）、异形指数（ID）、平均光度（AOD）、积分光度（IOD）、密度变化数（LDC）和平均灰度（AG）等参数指标，观察参数变化与PMI的关系。最后选取PMI12h至96h，与实验4的观察结果拟建多元推断方程，结合95％置信区间，评估比较单参数方程、多元方程推断PMI的准确性。结果上述7个DNA参数变化均与PMI显著相关（P＜0.001），相关系数为0.9511～0.9929。推断偏差分析显示，面积（A）推断方程平均推断偏差11.001h，MD为55.452h，ID为76.687h，AOD为48.405h，IOD为3.165h，LDC为35.197h，AG为8.918h。12h～96hPMI，AG（X7）与VH钠（X8）可拟建多元推断方程：Y1=451.103-2.412X8-0.576X7（r2=0.9975），95％置信区间和平均预测准确度较单一的VH钠或AG推断方程更好。其它不能拟合有意义的多元方程，如AG（X7）与VH钾（X9）拟合的PMI推断方程为Y2=7.424X9+1.860X7-457.655（r2=0.9812），该方程对置信区间无显著影响。结论死后120h内，家兔角膜上皮基底细胞DNA含量与死亡时间相关，其中A、IOD和AG建立的PMI推断方程平均推断偏差较小，具有较高研究价值。拟建多元方程应进行统计分析和置信区间测算；死后12h～96h，同时观测VH钠含量及角膜上皮基底细胞细胞核DNA平均灰度（AG）的死后变化，可显著提高推断准确性。
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相关论文文献
- [1].尸体化学的研究进展[J]. 法医学杂志 2015(04)
- [2].家猪死后脑组织GC-MS检测和死亡时间推断的研究[J]. 中国法医学杂志 2019(02)