鸡α干扰素基因及其下游基因Mx的研究

论文摘要

鸡α干扰素是鸡免疫相关细胞产生的一种高活性、多功能的生物活性糖蛋白,具有抗病毒活性。鸡α干扰素基因在受到禽流感病毒、新城疫病毒等外源物刺激后表达,然后诱导其下游抗病毒蛋白（AVP）基因表达,一起发挥抗病毒活性。其中Mx基因是一种十分重要的干扰素激活基因（ISG）,所编码的Mx蛋白是目前国际上最为广泛研究的几种抗病毒蛋白之一。鉴于此,本研究对鸡α干扰素及其下游基因Mx展开研究,为控制和治疗禽类致病性病毒感染提供新的思路和手段。本研究选用H9N2 G1-like亚型禽流感病毒对健康6周龄雏鸡进行攻毒,攻毒3天后处死,取肺部提取总RNA,采用RT-PCR克隆鸡α干扰素（ChIFN-α）基因,构建原核表达重组质粒ChIFN-α-pGEX-5X3,经酶切鉴定,DNA测序等证实重组质粒构建正确。其序列全长489 bp,与IFNA3 （Accession: X92478）核苷酸序列相似性高达99%,说明鸡α干扰素基因相对保守。将ChIFN-α-pGEX-5X3转化Rosetta（DE3）plysS宿主菌,IPTG诱导,SDS-PAGE和Western-blotting印迹分析表明其表达产物为45 kDa左右的融合蛋白。在此基础之上,本研究进一步采用上述技术路线克隆鸡α干扰素下游基因Mx（ChMx）,分别构建原核表达重组质粒ChMx-pGEX-4T3和真核表达重组质粒ChMx-pEGFP-N1,经酶切鉴定,DNA测序等证明重组质粒构建准确无误。继而将ChMx-pGEX-4T3转化Rosetta（DE3）plysS宿主菌, IPTG诱导, SDS-PAGE和Western-blotting印迹证实Mx表达产物为94 kDa左右的融合蛋白。最后割胶回收重组蛋白,与弗氏佐剂混匀制作免疫原,对SPF新西兰大白兔进行三次免疫（第一次为弗氏完全佐剂,后续为弗氏不完全佐剂）,获得效价为1:400的多克隆抗体。对本课题组成功克隆到的鸡Mx基因编码的氨基酸序列与GenBank登陆的鸡和鸭的Mx基因编码的氨基酸进行多重比对,发现编码鸡Mx蛋白的氨基酸序列呈现高度多态性,序列中呈现14个多态性位点,主要集中在N末端,第631位氨基酸均为Asn或者Ser。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 英文缩写词表
• 第一章 前言
• 1.1 干扰素研究进展
• 1.1.1 干扰素的分类及其分子结构
• 1.1.2 干扰素抗病毒作用机制
• 1.1.3 干扰素信号通路
• 1.1.4 禽类干扰素研究概况
• 1.2 Mx 基因研究进展
• 1.2.1 Mx基因的多样性
• 1.2.2 Mx蛋白的结构及其抗病毒活性
• 1.2.3 鸡Mx基因多态性及功能多样性
• 1.3 禽流感概况
• 1.4 本研究的目的和意义
• 第二章 鸡α干扰素基因克隆、序列分析及原核表达
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 材料
• 2.1.2 方法
• 2.1.2.1 攻毒实验
• 2.1.2.2 总RNA提取
• 2.1.2.3 RT-PCR
• 2.1.2.4 ChIFN-α-pGEX-5X3 原核表达载体的构建
• 2.1.2.5 感受态细胞制备与转化
• 2.1.2.6 重组子的鉴定
• 2.1.2.7 ChIFN-α序列分析
• 2.1.2.8 重组质粒ChIFN-α-pGEX-5X3 在Rosetta（DE3）plysS中表达
• 2.1.2.9 表达条件的优化
• 2.1.2.10 ChIFN-α原核表达重组蛋白的纯化
• 2.1.2.11 Western blotting分析
• 2.2 结果与分析
• 2.2.1 ChIFN-α基因的克隆
• 2.2.2 ChIFN-α-pGEX-5X3 原核表达载体的构建
• 2.2.3 ChIFN-α序列分析
• 2.2.4 重组质粒ChIFN-α-pGEX-5X3 在Rosetta（DE3）plysS中表达
• 2.3 讨论
• 2.3.1 鸡α干扰素基因克隆及其序列分析
• 2.3.2 鸡α干扰素基因在Rosetta（DE3）plysS中表达
• 2.3.3 ChIFN-α作为核酸疫苗的免疫佐剂
• 第三章 鸡Mx基因原核表达、多克隆抗体制备及氨基酸序列多态性分析
• 3.1 材料方法
• 3.1.1 材料
• 3.1.2 方法
• 3.1.2.1 引物设计
• 3.1.2.2 PCR扩增
• 3.1.2.3 Mx-pGEX-4T3 原核表达载体的构建
• 3.1.2.4 ChMx-pGEX-4T3 重组质粒在Rosetta（DE3）plysS中表达
• 3.1.2.5 Western blotting分析
• 3.1.2.6 ChMx原核表达重组蛋白的纯化
• 3.1.2.7 兔抗ChMx蛋白抗体的制备
• 3.1.2.8 斑点酶联免疫吸附法（Dot enzyme-linked immunosorbent assay,Dot-ELISA） 检测兔血清中抗体效价
• 3.1.2.9 Western blotting检测兔血清中抗ChMx多克隆抗体
• 3.1.2.10 ChMx-pEGFP-N1 真核表达载体的构建
• 3.1.2.11 Mx蛋白氨基酸序列多态性分析
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 ChMx-pGEX-4T3 原核表达载体的构建
• 3.2.2 重组质粒ChMx-pGEX-4T3 在Rosetta（DE3）plysS中表达
• 3.2.3 Bradford法的回归方程及相关系数的确定
• 3.2.4 Mx-pEGFP-N1 真核表达载体的构建
• 3.2.5 Mx蛋白氨基酸序列多态性分析
• 3.3 讨论
• 3.3.1 Mx蛋白氨基酸序列多态性
• 3.3.2 原核表达载体和宿主的选择
• 3.3.3 多克隆抗体的制备
• 3.3.4 真核表达载体的构建
• 第四章 结论与展望
• 4.1 结论
• 4.2 展望
• 附章 F型沙眼衣原体主外膜蛋白基因omp1 原核表达及其序列分析
• 1 材料与方法
• 1.1 实验材料
• 1.2 实验方法
• 1.2.1 沙眼衣原体主外膜蛋白基因omp1 的克隆
• 1.2.2 沙眼衣原体主外膜蛋白基因omp1 序列分析
• 1.2.3 沙眼衣原体主外膜蛋白基因omp1 的原核表达
• 1.2.4 重组质粒粒Omp1-pGEX-5X3 在Rosetta（DE3）plysS中表达
• 1.2.5 Omp1-pEGFP-N1 真核表达载体的构建
• 2 结果与分析
• 2.1 omp1 基因的克隆
• 2.2 omp1 基因的序列分析
• 2.3 F型沙眼衣原体主外膜蛋白基因omp1 原核表达载体的构建
• 2.4 Omp1-pGEX-5X3 在Rosetta（DE3）plysS中表达
• 2.5 Omp1-pEGFP-N1 真核表达载体的构建
• 3 讨论
• 3.1 沙眼衣原体流行病学
• 3.2 omp1 用于沙眼衣原体分型
• 3.3 MOMP作为沙眼衣原体疫苗的最佳的候选抗原
• 4 小结
• 参考文献
• 附录1 常用试剂配置
• 附录2 载体信息
• 致谢
• 个人简历及论文发表情况