Ⅰ四川水稻立枯丝核菌的遗传分化与致病力研究 Ⅱ水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达与序列分析

论文摘要

水稻立枯丝核菌（R.solani）是丝核菌属（Rhizoctonia）的一个种,为半知菌亚门真菌,其分布广、寄主范围大,不产生无性孢子,常以菌核形态习居土壤,是玉米、水稻、草坪草、马铃薯等农作物和纹枯病的致病菌。根据菌丝融合与否,立枯丝核菌可划分为14个融合群（AG-1—AG-13和AG-BI）。1987年。Ogoshi等根据培养性状、寄主以及生理生化等特性分成不同的种内类群（Intraspecificgroup,ISG）,其中的一个融合群AG-1划分AG-1IA、AG-1IB、AG-1IC三个亚群。立枯丝核菌的AG-1IA亚群是水稻和玉米纹枯病的优势致病菌群,纹枯病在我国长江流域高温、高湿条件下年年发生,是水稻和玉米等农作物年年减产的主要因素之一。在四川,立枯丝核菌也造成水稻、玉米严重减产。因此,充分认识我省水稻立枯丝核菌（R.solani）生理小种变化的特点,进行综合防治立枯丝核菌,提高抗病育种水平显得尤其重要。G蛋白是膜协同、异三聚体蛋白,由α、β、γ3个亚单位组成。G蛋白及其受体（GPCRs）组成了真核生物细胞里最流行的信号系统、感官多样调节系统、细胞生长和激素调节系统。G蛋白β亚基呈现出一种桶形β折叠结构,并包含WD40重复序列,其前端具有N端α螺旋,是G蛋白功能GTP连接转换器。Gilman等研究表明,在真核生物中G蛋白β亚基基因参与信号传导途径,导致基因表达、细胞功能受到影响。在很多能对植物致病的病原真菌,如Dictyosteliumdiscoideum、Ustilagomaydis和Fusarium oxysporum中,G蛋白在整个代谢生长过程中都起着举足轻重的作用,涉及细胞生长、分化和毒性等。Kasahara等对Cryphonectria parasitica的研究发现,G蛋白β亚基基因功能丧失转基因菌株的菌丝缺乏明显分叉,对植物侵染和致病力明显降低。本研究从四川不同生态区分离到水稻立枯丝核致病菌55株,研究其遗传分化、致病力分化和聚类分析,并利用同源克隆方法分离水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因,对其功能做了些初步的研究,为研究水稻立枯丝核菌致病机理和对应防治方法奠定基础。实验主要结果如下:1.通过水琼脂分离法共得到水稻立枯丝核菌菌株55株。2.水稻立枯丝核菌菌丝融合:所有分离全部菌株中除D42都与标准菌株AG-1IA发生菌丝融合。部分菌株不仅仅能与其中的一种标准菌株发生菌丝融合,而且还能同时与其它一种或者多种标准菌株发生菌丝融合,这说明在细胞学水平上,这些立枯丝核菌具有多个菌群归属性,因此这类立枯丝核菌为桥梁菌群。3.水稻立枯丝核菌致病力鉴定:室内采用离体叶片接种法,分别接种X400、蜀恢527R、蜀恢881R。结果表明,各菌株间致病力差异显著。田间采用始穗期嵌入接种法,结果表明,各菌株间致病力差异显著。同时发现,相同菌株同时接种三种材料时,室内离体鉴定方法的致病力对不同材料差异较小,而活体接种方法表现出很大的材料间差异。4.RAPD分子标记聚类分析:结果显示,在相似系数0.91处,除D42、D54以外的所有分离菌株与AG-1IA可聚为一类,而外群对照菌株A-1和另外9个国际标准菌株分别归属一类。以相似系数0.941为标准,可以把55个水稻立枯丝核菌菌株为8类:D1、D35、D6等40个为第1类;D36、D39、D40、D46、D41为第2类;D7和D20第3类;D37和D50为第4类:D2和D3为第5类;D47和D55为第6类;D42为第7类;D54为第8类。5.水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的同源克隆:利用衍生自T.cucumerisG蛋白β亚基基因序列的特异引物,对水稻立枯丝核菌菌株DNA进行PCR扩增。产物经1%琼脂糖凝胶电泳,可以观察到一条约1.9 kb大小的扩增带,与预期的G蛋白β亚基基因大小相吻合。经测序表明该片段为水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的扩增产物。softberry软件分析证实,该序列包含一个约1.7kb的完整开放阅读框,编码366个氨基酸。6.G蛋白beta亚基基因多态性及进化分析:对11个水稻立枯丝核菌菌株的G蛋白β亚基基因氨基酸序列作同源性比较。结果发现,他们之间同源性较高,但是,在某些区间发生变异。进化分析发现该序列与大量物种G蛋白β亚基基因明显同源,一致性介于88.14-57.34%。7.基因的表达模式分析:通过半定量RT-PCR法对水稻立枯丝核菌AG-1IA G蛋白β亚基基因在不同时期的表达量分析显示,水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因在前2 d几乎不表达,从第3天到第5天基因的表达量逐渐增大,在第5天时达到最大,第6天后表达量陡然降低到几乎不表达。因此,水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因在对数生长期表达量最大,提示水稻立枯丝核菌AG-1IA G蛋白β亚基基因可能具有时空表达特性。

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• 摘要
• ABSTRACT
• 第一部分 四川水稻立枯丝核菌（R.solani）的遗传分化与致病力研究
• 1 文献综述
• 1.1 立枯丝核菌发病历史和分布
• 1.2 病症和损失
• 1.3 病原菌
• 1.3.1 病原菌的分类地位
• 1.3.2 病原菌形态特点
• 1.3.3 病原菌培养形状
• 1.3.4 病原菌的致病力分化及菌丝融合群鉴定
• 1.3.5 病原菌的致病机制
• 1.4 生理学
• 1.4.1 病害循环
• 1.4.2 寄主组织的抗性反应和寄主范围
• 1.4.3 环境条件的效应
• 1.5 生物化学技术在菌丝融合群研究中的应用
• 1.5.1 血清技术和GC含量
• 1.5.2 DNA序列同源性
• 1.5.3 同工酶分析方法
• 1.6 DNA分子标记技术在菌丝融合群研究中的应用
• 1.6.1 DNA限制性酶切片段长度多态性（RFLP）
• 1.6.2 随机扩增的多态DNA（RAPD）
• 1.6.3 脉冲场电泳技术（PFGE）
• 1.7 病害流行因素
• 1.7.1 不可控因素的影响
• 1.7.2 可控因素的影响
• 1.8 防治
• 1.8.1 抗病种质资源的筛选和抗（耐）病品种的选育和利用
• 1.8.2 农业措施的应用
• 1.8.3 化学防治
• 1.8.4 生物防治
• 1.9 开题设想
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.2 立枯丝核菌的鉴定标准
• 2.3 立枯丝核菌培养基和接种技术规程
• 2.3.1 嵌入法接种立枯丝核菌
• 2.4 四川不同地区水稻立枯丝核菌株的分离
• 2.5 菌丝融合实验
• 2.6 致病力鉴定
• 2.7 菌株DNA的提取
• 2.8 RAPD分析
• 2.8.1 引物
• 2.8.2 RAPD反应
• 2.9 试验方法
• 2.9.1 田间设计
• 2.9.2 立枯丝核病菌接种
• 2.10 数据统计和分析
• 3 结果与分析
• 3.1 四川生态区菌株分离结果
• 3.2 菌丝融合
• 3.3 致病力鉴定
• 3.4 RAPD分析
• 3.5 聚类分析
• 4 讨论
• 4.1 四川水稻立枯丝核菌多样性与致病力关系
• 4.2 菌丝融合、致病力鉴定与RAPD聚类关系
• 4.3 关于接种方法
• 4.4 关于"桥梁分离物"菌株
• 参考文献
• 第二部分 水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆、表达及序列分析
• 1 文献综述
• 1.1 G蛋白基本结构和种类
• 1.2 G蛋白偶联的信号传导系统及各组分的结构和功能
• 1.3 G蛋白偶联信号传导系统在植物保护方面的研究
• 1.3.1 植物G蛋白的生化研究
• 1.3.2 植物G蛋白的分子研究
• 1.3.3 G蛋白参与植物及昆虫信号传导途径
• 1.4 G蛋白基因克隆及基因工程
• 1.4.1 G蛋白基因克隆
• 1.4.2 G蛋白的基因工程及体外表达系统
• 1.5 G蛋白β亚基基因研究
• 1.6 丝状真菌G蛋白β亚基基因研究
• 1.7 开题设想
• 2 材料和方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 供试菌株
• 2.1.2 药品与试剂
• 2.2 方法
• 2.2.1 菌株DNA提取
• 2.2.2 菌株总RNA的抽提
• 2.2.3 反转录—第一链cDNA合成
• 2.2.4 RT-PCR扩增反应
• 2.2.5 水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的克隆与测序
• 3 结果与分析
• 3.1 水稻立枯丝核菌RNA的提取结果
• 3.2 G蛋白β亚基基因克隆
• 3.3 水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因氨基酸序列同源分析
• 3.4 G蛋白β亚基基因氨基酸序列的系统进化树分析
• 3.5 水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因的差异表达
• 4 讨论
• 4.1 水稻立枯丝核菌G蛋白β亚基基因克隆
• 4.2 氨基酸序列特征分析
• 4.3 AG-1IA G蛋白β亚基基因表达
• 参考文献
• 附录-1 药品的配置
• 附录-2 图片
• 致谢
• 在读期间发表的文章