九孔鲍cDNA文库的构建、四种重要免疫相关蛋白的发现及其功能研究

论文摘要

鲍是一类重要的经济贝类品种,但是近年来由于环境污染和病害的发生而导致鲍的产量大幅度下降。为了探索研究鲍免疫反应相关机制,为鲍病害防治提供理论基础,本研究构建了九孔鲍血淋巴细胞cDNA文库,首次筛选出了4个尚未报道的鲍免疫反应相关基因：组氨酸核苷结合蛋白、胞嘧啶核苷脱氨酶、泛素连接酶Rbx1和胸腺肽β。并利用现代生物信息学分析手段,分子生物学、免疫学及细胞生物学等技术对这4个鲍新基因的结构和功能进行了研究。1.构建了九孔鲍血淋巴细胞cDNA文库共得到310个EST序列,其中包含18个鲍新基因全长序列。通过生物信息学软件分析,这些基因分别涉及到鲍的细胞代谢和生长、转录调控、物质合成、免疫反应等。并把相关基因序列提交到GenBank数据库。2.九孔鲍组氨酸核苷结合蛋白的鉴定与功能和机制的研究九孔鲍组氨酸核苷结合蛋白（ab-HINT） cDNA全长为616 bp,氨基酸序列与哺乳动物HINT有较高的相似度,并且包含三个保守的活性位点区域。组织表达分布研究表明：ab-HINT在鲍不同组织中均有表达,表现了其功能的多样性,并且在鲍血淋巴细胞和鳃中的表达水平要明显高于其他组织,暗示了ab-HINT在鲍免疫反应中起到一定的作用。另外,LPS和Poly I：C的刺激均能诱导ab-HINT的表达水平上升,进一步说明了ab-HINT在鲍免疫反应中的作用。为了进一步研究ab-HINT的生物学活性及生理学作用,表达和纯化了ab-HINT蛋白,并利用质谱技术鉴定。分析型超速离心机分析结果指明该ab-HINT是一个同源二聚体。同时,高效液相色谱分析表明ab-HINT蛋白能够水解AMP-NH2。利用制备的抗体,用免疫组化和免疫荧光的方法,研究了ab-HINT在鲍组织细胞中的表达定位。在这些研究的基础上,我们进一步探索研究了ab-HINT对鲍血淋巴细胞及肿瘤细胞的凋亡作用及其作用机制。结果表明：ab-HINT能够诱导鲍血淋巴细胞凋亡,有可能是通过凋亡调控因子P53来实现的。另外,ab-HINT能够增加肿瘤细胞凋亡比例,该凋亡通路可能是通过上调P53的表达,同时伴随着抗凋亡蛋白Bcl-2的下调和促凋亡蛋白Bax的上调来实现的。3.九孔鲍胞嘧啶核苷脱氨酶的鉴定及功能研究九孔鲍胞嘧啶核苷脱氨酶（ab-CDA） cDNA全长为1752 bp,氨基酸序列中包含两个保守的活性位点区域和一个保守的半胱氨酸/组氨酸残基。序列比对及进化树分析表明ab-CDA属于同源四聚体家族。组织表达分布研究表明：ab-CDA在鲍不同组织中均有表达,并且在鲍血淋巴细胞中的表达水平显著高于其他组织。同时,LPS和Poly I:C的刺激均能诱导ab-CDA的表达水平上升,说明了ab-CDA在鲍免疫反应中的作用。为了进一步研究ab-CDA的生物学功能,表达和纯化了ab-CDA蛋白,并用质谱技术鉴定。分光光度计分析表明该蛋白具有胞嘧啶核苷脱氨酶活性,同时,利用免疫组化的方法,研究了ab-CDA在鲍组织细胞中的表达定位,结果表明：ab-CDA在胞质和胞核均有表达。4.九孔鲍泛素连接酶Rbx1的鉴定及功能研究九孔鲍泛素连接酶Rbx1 （ab-Rbxl）的cDNA全长为509 bp,氨基酸序列与其他Rbx1同源物有较高的相似度,并且ab-Rbx1氨基酸序列中含有Rbx1蛋白家族的特征区域ring box序列。组织表达分布研究表明：ab-Rbx1在鲍不同组织中均有表达,并且在鲍血淋巴细胞中的表达水平相对高于其他组织。同时,PHA的刺激能显著诱导ab-Rbx1的表达水平上升。说明了ab-Rbx1具有广泛的生物学功能,其中在免疫反应中起到一定的作用。为了进一步研究ab-Rbx1功能,表达和纯化了ab-Rbx1蛋白,并利用免疫组化和免疫荧光的方法,研究了ab-Rbx1在鲍组织细胞中的表达定位,结果表明ab-Rbx1在细胞质和细胞胞核均有一定表达,进一步说明了ab-Rbx1功能的多样性。另外,体外泛素化检测分析表明：ab-Rbx1具有泛素连接酶活性,并且这种活性依赖ATP,表明了泛素化修饰在软体动物鲍中的保守性。5.九孔鲍胸腺肽β的鉴定与表达分析研究九孔鲍胸腺肽β（ab-TMSB）的cDNA全长为499 bp,氨基酸序列与其他胸腺肽β同源物具有较高的相似性,并且序列中包含保守的肌动蛋白结合区,该区域是胸腺肽β蛋白家族的特征区。组织表达分布研究表明：ab-TMSB在鲍各检测的组织中均有一定的表达,表明ab-TMSB在鲍中具有广泛的生物学作用。并且ab-TMSB在血淋巴细胞中的表达要显著高于其他检测组织,暗示了ab-TMSB在鲍免疫反应中发挥一定的作用。进一步用实时定量PCR检测了ab-TMSB在大肠杆菌脂多糖（LPS）刺激后的表达变化,结果表明LPS能显著提高ab-TMSB的表达水平,初步揭示了ab-TMSB在鲍免疫反应中的作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一篇 文献综述及技术路线
• 第一章 组氨酸三聚体核苷结合蛋白（HINT）研究进展
• 1 HINT的发现及结构特点
• 1.1 HINT的发现和命名
• 1.2 HINT的结构特点
• 2 HINT的功能
• 2.1 生物学活性（酶催化作用）
• 2.2 转录调控作用
• 2.3 肿瘤抑制作用
• 3 其他超家族成员概况
• 4 结语
• 第二章 胞嘧啶核苷脱氨酶研究进展
• 1 CDA的结构与分类
• 2 CDA与疾病诊断
• 2.1 类风湿性疾病的诊断
• 2.2 肝胆疾病的诊断
• 2.3 病理妊娠的早期诊断
• 2.4 急性白血病的疗效诊断
• 3 CDA的检测方法
• 3.1 氨间接测定法
• 3.2 紫外分光光度法
• 3.3 放射性同位素法
• 3.4 液相色谱法
• 4 CDA与肿瘤治疗
• 4.1 结肠癌
• 4.2 肝癌
• 4.3 胃癌
• 4.4 肝结肠转移癌
• 4.5 肉瘤
• 4.6 CDA基因治疗的特征
• 5 结语
• 第三章 泛素连接酶研究综述
• 1 泛素化
• 2 泛素化相关的酶
• 2.1 E1泛素活化酶
• 2.2 E2泛素结合酶
• 2.3 E3泛素连接酶
• 2.4 泛素蛋白酶体途径的其他成分
• 3 泛素连接酶
• 3.1 HECT结构域家族连接酶结构与功能特点
• 3.2 U-box结构域的泛素连接酶
• 3.3 RING结构域家族的泛素连接酶
• 4 结语
• 第四章 β胸腺肽研究进展
• 1 胸腺肽Tβ4结构特点
• 2 生物学功能
• 2.1 维持细胞骨架
• 2.2 抗感染及促伤口愈合
• 2.3 血管生成
• 2.4 细胞凋亡
• 2.5 胸腺肽β4与肿瘤生成
• 3 结语
• 技术路线图
• 第二篇 九孔鲍cDNA文库的构建
• 第五章 九孔鲍受脂多糖刺激后血淋巴细胞全长cDNA文库的构建和筛选
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 总RNA的制备
• 2.2 双链cDNA的合成
• 2.3 Chroma SPIN-400过柱分馏
• 2.4 噬菌体文库滴度及重组效率
• 2.5 质粒PCR筛选
• 2.6 测序结果分析
• 3 讨论
• 第三篇 九孔鲍四种重要免疫相关蛋白的发现及其功能研究
• （一）九孔鲍HINT的鉴定与功能和机制的探索性研究
• 第六章 九孔鲍HINT的序列分析、组织表达分布及在免疫反应中的作用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鲍HINT的全长克隆
• 2.2 鲍HINT的序列分析
• 2.3 鲍HINT的组织表达分布及在免疫反应中的作用
• 3 讨论
• 第七章 九孔鲍HINT的原核表达、鉴定、细胞内定位、生物活性及二聚体结构分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 原核表达载体的构建
• 2.2 鲍HINT的原核表达、纯化及鉴定
• 2.3 鲍HINT二聚体结构分析
• 2.4 鲍HINT的生物活性分析
• 2.5 多克隆抗体制备及Western blot分析ab-HINT在鲍中的表达情况
• 2.6 细胞内定位
• 3 讨论
• 第八章 九孔鲍HINT蛋白对鲍血淋巴细胞以及人肿瘤细胞的作用及机制研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鲍HINT诱导血淋巴细胞凋亡的电镜分析结果
• 2.2 鲍HINT诱导血淋巴细胞凋亡的流式细胞仪分析结果
• 2.3 鲍诱导血淋巴细胞凋亡中的作用机制探索
• 2.4 鲍HINT诱导肿瘤细胞凋亡的电镜分析结果
• 2.5 鲍HINT诱导肿瘤细胞凋亡的流式细胞仪分析结果
• 2.6 鲍HINT诱导肿瘤细胞凋亡的作用机制探索
• 3 讨论
• （二）九孔鲍CDA的鉴定与功能的探索性研究
• 第九章 九孔鲍CDA的序列分析、组织表达分布及在免疫反应中的作用
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鲍CDA的全长克隆
• 2.2 鲍CDA的序列分析
• 2.3 鲍CDA的组织表达分布及在免疫反应中的作用
• 3 讨论
• 第十章 九孔鲍CDA的原核表达、生物活性分析及细胞内的定位
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 原核表达载体的构建
• 2.2 鲍CDA的原核表达、纯化及鉴定
• 2.3 鲍CDA的生物活性分析
• 2.4 多克隆抗体制备及Western blot分析
• 2.5 鲍CDA在蛋白水平上的表达分析
• 2.6 鲍CDA在鲍组织细胞内的定位
• 3 讨论
• （三）九孔鲍Rbx1的鉴定与功能的研究探讨
• 第十一章 九孔鲍Rbx1的序列分析、组织表达分布及其与免疫的关系探讨
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鲍Rbx1的全长克隆
• 2.2 鲍Rbx1的序列分析
• 2.3 鲍Rbx1的组织表达分布及PHA诱导刺激后表达变化
• 3 讨论
• 第十二章 九孔鲍Rbx1的原核表达、细胞内定位及泛素化修饰
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 原核表达载体的构建
• 2.2 鲍Rbx1的原核表达、纯化及鉴定
• 2.3 多克隆抗体制备及Western blot分析
• 2.4 组织细胞内定位
• 2.5 体外自身泛素化修饰
• 3 讨论
• （四）九孔鲍胸腺肽β的克隆鉴定与表达分析
• 第十三章 九孔鲍胸腺肽β的克隆鉴定与表达分析
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 鲍胸腺肽β的全长克隆
• 2.2 鲍胸腺肽β的序列分析
• 2.3 鲍胸腺肽β的组织表达分布及在免疫反应中的作用
• 4 讨论
• 全文小结
• 参考文献
• 个人简历
• 攻读博士期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢