含硒谷胱甘肽转硫酶的设计和构建及其在Escherichia coli中的表达研究

论文摘要

硒是人体必需的微量元素之一。在生物体内,它主要通过构成含硒酶来发挥作用。随着对谷胱甘肽过氧化物酶（Glutathioneperoxidase,GPX）研究的深入,研究人员发现硒是GPX 催化反应的必要组分,且以硒代半胱氨酸（selenocysteine, Sec）的形式作为酶的催化基团发挥作用。Sec 是由终止密码子UGA 编码,以共翻译的形式插入到新生肽链中。因此,Sec 又被称为第21 种氨基酸。在Escherichia coli 中,Sec 的表达效率只有正常氨基酸的1-3%,因此硒蛋白的体内表达量非常低。而且,Sec 插入依赖的原核生物硒代半胱氨酸插入序列（Selenocysteine InsertionSequence, SECIS）具有种属特异性,因而表达的异源硒蛋白需要引入大肠杆菌的SECIS 元件。在本文工作中,我们探讨了真核硒蛋白在大肠杆菌中的表达。酶催化的本质是底物结合和分子内催化。谷胱甘肽分子是谷胱甘肽转硫酶（Glutathione S-transferases,GST）和谷胱甘肽过氧化物酶的共同底物,但是两者活性部位的催化残基不同,因而催化的化学反应也不同。为了获得含Sec 的谷胱甘肽转硫酶,我们将野生型谷胱甘肽转硫酶活性部位催化残基的Tyr7 的密码子UAU突变为Sec 的密码子UGA,同时在其下游引入SECIS 元件,利用大肠杆菌直接表达。实验结果表明, GST-Sec 蛋白得到了成功表达。

论文目录

• 第一章 前言
• 第二章 含硒谷胱甘肽转硫酶的设计与构建
• 一、材料与方法
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 二、结果分析
• 1. 含硒 GST 突变体的设计
• 2. GST 突变体的构建
• 3. GST 融合表达系统的构建
• 第三章 含硒谷胱甘肽转硫酶在Eschericoli coli中的表达
• 一、材料与方法
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法
• 二、结果分析
• 1. sjGSTG,ST-S,GST-UG,ST-Sec 目的基因的诱导表达
• 2. sjGST /sjGST 和sjGST /GST-Sec 目的基因的诱导表达
• 3. PelB /GST-Sec 目的基因的诱导表达
• 第四章、讨论
• 参考文献
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 致谢