耐头孢他啶革兰氏阴性杆菌β-内酰胺酶的特性研究

论文摘要

目的 研究临床耐 CAZ 革兰氏阴性杆菌β-内酰胺酶的特性。方法 用 K-B 纸片扩散法和琼脂稀释法了解细菌的耐药谱;超声破碎法提取粗酶, IEF 测定β-内酰胺酶的 pI 值;碱裂解法提取细菌的总 DNA,以之为模板进行 PCR 扩增检测 β-内酰胺酶的基因类型;将 PCR 产物通过T-A 克隆连接到 pMD-18T 载体上对β-内酰胺酶基因进行测序;用饱和硫酸铵反抽提、 Sephadex G-75 凝胶过滤和 DEAE-52 阴离子交换层析等方法纯化β-内酰胺酶;SDS-PAGE 法测定酶分子量;紫外分光光度法测定酶动力学参数。结果 从 97 株临床耐药革兰氏阴性杆菌中获得 9株耐 CAZ 并产 ESBLs 的细菌。CR01 和 CR03 各产两种β-内酰胺酶,其余 7 株菌只产单一酶,共包括四个 pI 值:5.5、5.6、7.5 和 8.7。7株产单一β-内酰胺酶细菌对第一、二、三代头孢菌素均耐药（MIC≥32μg/ml）,对 IPM 敏感（MIC≤1μg/ml ）,联合使用 β-内酰胺酶抑制剂 SBT 或 TAZ 的 MIC 均下降三个以上的对倍稀释度。基因分析显示,CR04 含有 blaSHV基因, SHV-1 相比较,发生了 38 个氨基酸取代,pI 为7.5。 CR05β-内酰胺酶基因为 blaTEM,与 TEM-28 相比较,发生了 4 个氨基酸取代,分别为 Asn-50→Asp,His-162→Arg,Ala-170→Asp 和Lys-237→Glu,pI 为 5.5。CR09β-内酰胺酶基因为 blaCTX-M,与 CTX-M-1比较,存在 3 个氨基酸突变,分别为 Val-80→Ala, Asp-117→Asn 和Ser-143→Ala,pI 为 8.7。此 3 种β-内酰胺酶的分子量均为 29kDa,均能水解 CTX、CAZ 和 AZ,其活性能被 SBT 和 TAZ（IC50≤220nmol/L）有效抑制,TAZ 的抑制作用强于 SBT。结论 耐 CAZ 临床革兰氏阴性杆菌仍对IPM和β- 内酰胺类抗生素/β-内酰胺酶抑制剂复合制剂敏感;

论文目录

• 符号说明
• 中文摘要
• 英文摘要
• 论文正文：耐头孢他啶革兰氏阴性杆菌β-内酰胺酶的特性研究
• 前言
• 第一部分 耐头孢他啶革兰氏阴性杆菌的药物敏感实验和表型分析
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法和步骤
• 3. 实验结果
• 第二部分 耐头孢他啶革兰氏阴性杆菌β-内酰胺酶的基因分析
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法和步骤
• 3. 实验结果
• 第三部分 耐头孢他啶革兰氏阴性杆菌β-内酰胺酶的生化特性研究
• 1. 实验材料
• 2. 实验方法和步骤
• 3. 实验结果
• 讨论
• 全文小结
• 本课题的创新点
• 参考文献
• 文献综述
• 5HV 型β-内酰胺酶的研究进展
• 致谢
• 攻读学位期间发表的学术论文