论文摘要
缺血性脑血管病已经成为威胁人类生命健康的一种主要疾病，尽管在梗死后的再通方面已经取得了一定的进展，但是在缺血后再灌注的干预上，效果较差。在进一步深入探索脑缺血再灌注损伤的特点、规律和发生机制时，发现脑缺血再灌注损伤的病理过程复杂，学者们倾向于联合应用针对多种机制的药物进行治疗，并初步证实“鸡尾酒”疗法（联合治疗）是可行的。益气活血法由益气药和活血药组成，多年来作为中风病主要治法之一而得到广泛应用。近年来，具有活血化瘀作用的三七总皂苷注射液（商品名：血栓通或血塞通），应用于急性中风的治疗，取得了一定的疗效。近期，临床报道血栓通或血塞通注射液和黄芪注射液联用，具有一定的协同作用。根据文献的检索，经过分析认为，其中的三七总皂苷和黄芪总皂苷是其作用的有效部位，两者合用可能产生协同作用。因此，首先，通过对不同型号的大孔树脂、洗脱液的浓度、洗脱溶媒量的筛选实验，经过纯化验证和HPLC图谱分析，确立生产工艺路线，制备可靠的实验用药物。然后，以局灶性脑缺血再灌注大鼠的脑梗死百分率和脑缺血再灌注小鼠的脑水肿为指标，应用均匀设计、2x2析因设计，进行实验分组、结果分析。结果发现：模型大鼠出现了明显的脑梗死，模型小鼠脑组织含水量明显升高。三七总皂苷和黄芪总皂苷合用（PNS-TSA）后能降低模型大鼠脑梗死百分率，能降低模型小鼠脑含水量，表现出相加的协同作用；并得到了优化剂量。以该剂量为基础，开展了以下研究：PNS-TSA对大鼠脑缺血再灌注损伤的保护作用。采用CCAO大鼠模型，干湿重法观察PNS-TSA对脑组织含水量的影响；静脉注射伊文思兰，观察PNS-TSA对脑血管通透性的影响。采用线拴法MCAO大鼠模型，观察PNS-TSA对脑梗死百分率、脑组织病理形态学的影响。结果表明：PNS-TSA能显著降低模型大鼠脑微血管的通透性和脑含水量，改善脑水肿；明显减小脑梗死百分率，改善脑组织病理性损伤，对大鼠脑缺血再灌注损伤显示出保护作用。PNS-TSA对CCAO小鼠脑组织抗氧化作用的影响。采用CCAO小鼠模型，以T-SOD、MDA、NOS、GSH、GSHopX、T-AOC、CAT、H2O2为指标，观察PNS-TSA对缺血再灌注脑组织抗氧化作用的影响。结果表明，PNS-TSA具有抗氧化损伤的作用，这种作用主要和提高病理状态下的SOD、CAT活力有关。PNS-TSA对MCAO大鼠脑组织中性粒细胞浸润、COX-2活性及相关因子的影响。采用线拴法MCAO大鼠模型，ELISA法检测脑组织中ICAM-1含量、CINC含量、MMP-9含量、PGE2含量、TNF-α含量、IL-1β含量；比色法检测脑组织中MPO活性、COX-2含量；RT-PCR法半定量IL-6mRNA；原位分子杂交法半定量COX-2mRNA。结果显示：PNS-TSA对CINC、TNF-α、IL-1β、ICAM-1、MPO、COX-2、PGE2的活性或含量和IL-6mRNA、COX-2mRNA表达，具有显著的抑制作用，对MMP-9含量未见显著变化。PNS-TSA对MCAO大鼠p-IκBα、IκBα表达、NF-κBp65表达和核转位的影响。采用线拴法MCAO大鼠模型，Western blot法检测p-IκBα、IκBα蛋白表达；免疫组化法检测NF-κBp65表达和核转位。结果显示：PNS-TSA组与模型组比较，缺血区皮层和尾壳核区，NF-κBp65阳性表达面积和累积光密度值显著减少，脑组织中p-IκBα蛋白表达量显著减少，IκBα蛋白表达量显著增加。综合实验结果，认为：PNS-TSA抑制脑组织损伤的作用和其抑制该过程中的炎症反应和抗氧化有关。通过抑制TNF-α、IL-1β、ICAM-1、CINC的表达，抑制中性粒细胞与血管内皮的黏附、聚集，降低中性粒细胞的趋化运动，减弱中性粒细胞在缺血脑组织的浸润和活化：通过抑制IκB-α的降解，减少NF-κB的核转位，抑制COX-2、IL-6的转录，降低COX-2的活性和前列腺素的生成，最终减轻了脑组织的损伤。提示：PNS-TSA可能通过抑制IκB-α的降解，减少NF-κB的核转位，阻碍其效应基因如COX-2、IL-6等的转录和表达，抑制炎症级联反应。实验结果表明：与模型组比较，PNS组IκBα蛋白表达量显著增加，p-IκBα蛋白表达量显著减少，NF-κB核易位明显减弱，其免疫反应阳性表达物多在胞浆与核中共存，阳性面积和积分光密度明显降低，实验结果均为首次发现，有助于揭示PNS抑制脑缺血再灌注损伤的药理作用机制。与PNS组（80mg／kg）比较，同PNS剂量的PNS-TSA（112mg／kg）组缺血脑组织中的IL-1β含量、MPO活性显著降低；除上述指标外，优化剂量PNS-TSA（56mg／kg）组与PNS组比较，缺血脑组织中NF-κB阳性面积和积分光密度、TNF-α含量、COX-2、COX-2mRNA的表达均显著降低。上述结果提示：PNS合用TSA，抑制缺血脑组织中性粒细胞浸润、炎性因子表达和NF-κB活化的作用增强；应用TSA后，可以减少PNS的用量，又达到增效的效果。本研究的创新点：首次对三七总皂苷和黄芪总皂苷抗实验性脑缺血再灌注损伤进行了优化剂量筛选，得到了优化剂量，证实两者的合用具有协同作用。首次发现，PNS-TSA抑制IκB-α的降解，减少NF-κB的核转位，阻碍COX-2、IL-6等的转录和表达。提示：PNS-TSA抑制炎症级联反应的机制和NF-κB的信号转导有关。上述发现，未见国内外的相关报道。PNS合用TSA，抑制缺血脑组织中性粒细胞浸润、炎性因子表达和NF-κB活化的作用增强；应用TSA后，可以减少PNS的用量，又达到增效的效果。
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标签：脑缺血再灌注损伤论文; 炎症反应论文;