利用糖质原料产L-丝氨酸菌株SYPS-062的代谢机制初探

论文摘要

本论文以一株由自然界筛选获得的能够利用糖质原料产L-丝氨酸的菌株SYPS-062为研究对象,采用形态学、生理生化性状分析和16S rDNA基因序列分析对细菌SYPS-062的分类地位进行了研究,确定了SYPS-062在分类学上的地位为谷氨酸棒杆菌属。构建了谷氨酸棒杆菌L-丝氨酸代谢网络,分析SYPS-062的代谢通量的分布特点,并且根据代谢通量分析结果对关键酶基因进行深入分析,得到如下结果:1、采用形态学、生理生化性状分析和16S rDNA基因序列分析对细菌SYPS-062的分类地位进行了研究,确定了SYPS-062归属于谷氨酸棒杆菌属的分类学地位。为进一步分析SYPS-062积累L-丝氨酸的机制奠定基础,考察了SYPS-062在营养肉汤培养基中的生长情况并绘制了生长曲线。2、构建了谷氨酸棒杆菌Corynebacterium glutamicum的代谢平衡模型,应用该模型分别计算出SYPS-062 L-丝氨酸快速合成阶段及模式菌株ATCC13032同等时期的代谢通量分布情况。结果表明,利用糖质原料积累L-丝氨酸的谷氨酸棒杆菌SYPS-062中仅有6.4%的碳架进入HMP途径,而模式菌株ATCC13032的HMP途径有29.6%的碳架流入,为解释以上两种菌物量积累差异提供了充分证据;磷酸烯醇式丙酮酸（PEP）节点涉及OAA的回补反应,以上两种菌株在该点的代谢通量分布相近,说明该节点是谷氨酸棒杆菌回补反应的关键节点;3-磷酸甘油酸（G-3-P）是碳架进入L-丝氨酸代谢途径的重要节点,代谢通量分析结果从量的角度说明了两株菌的代谢分布差异,为进一步研究工作提供理论支持。3、通过代谢通量分析可知,L-丝氨酸代谢支路代谢通量分布差异是导致L-丝氨酸积累的关键因素之一,其中丝氨酸羟甲基转移酶有关L-丝氨酸的降解和菌体代谢过程中一碳单元的生成,是该通路中的关键节点,故选取丝氨酸羟甲基转移酶glyA基因为研究对象,比较了C. glutamicum SYPS-062及模式菌株ATCC13032 glyA基因的异同。实验结果表明,SYPS-062和ATCC13032的glyA基因序列同源性为99.54%,说明不同来源的glyA基因高度同源,两种不同来源的glyA基因在大肠杆菌表达得到重组蛋白的比活力存在微小差异,排除了对glyA基因存在较大差异的推测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一章 绪论
• 1.1 L-丝氨酸的研究背景
• 1.2 L-丝氨酸及其生物学意义
• 1.3 L-丝氨酸的理化性质
• 1.4 L-丝氨酸的应用
• 1.4.1 L-丝氨酸在医药领域的应用
• 1.4.2 L-丝氨酸在食品领域的应用
• 1.4.3 L-丝氨酸在化妆品方面的应用
• 1.5 L-丝氨酸的生产概况
• 1.5.1 蛋白质水解提取法
• 1.5.2 化学合成法
• 1.5.3 生物酶法
• 1.5.4 前体发酵法
• 1.6 微生物直接合成L-丝氨酸及其代谢工程的研究
• 1.7 本论文的研究思路与内容
• 第二章 利用糖质原料产L-丝氨酸菌株SYPS-062 的鉴定
• 2.1 材料与方法
• 2.1.1 菌株和质粒
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 工具酶
• 2.1.4 主要试剂
• 2.1.5 主要仪器
• 2.1.6 实验方法
• 2.2 结果与讨论
• 2.2.1 细菌SYPS-062 的菌落表型
• 2.2.2 菌株SYPS-062 的生理生化特征
• 2.2.3 菌株 SYPS-062 16S rDNA 基因的获得
• 2.2.4 PCR 产物的TA 克隆以及序列测定
• 2.2.5 细菌SYPS-062 的种属确定
• 2.2.6 SYPS-062 的生长曲线
• 2.3 本章小结
• 第三章 SYPS-062 与谷氨酸棒杆菌模式菌株ATCC13032 的代谢通量的比较分析
• 3.1 材料与方法
• 3.1.1 菌种
• 3.1.2 培养基
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养方法
• 3.1.5 分析方法
• 3.1.6 谷氨酸棒杆菌C. glutamicum 代谢网络的构建
• 3.1.7 代谢通量研究的数学基础和代谢方程组的求解
• 3.2 结果与分析
• 3.2.1 C. glutamicum 积累L-丝氨酸菌株SYPS-062 与模式菌株ATCC13032 发酵过程的比较
• 3.2.2 C. glutamicum SYPS-062 与ATCC13032 的胞内代谢通量分析
• 3.3 本章小结
• 第四章 谷氨酸棒杆菌SYPS-062 GLYA 基因序列的分析
• 4.1 材料与方法
• 4.1.1 菌株和质粒
• 4.1.2 培养基和培养条件
• 4.1.3 工具酶
• 4.1.4 主要试剂
• 4.1.5 主要仪器
• 4.1.6 实验方法
• 4.2 结果与分析
• 4.2.1 菌株SYPS-062 及ATCC13032 的glyA 基因的扩增
• 4.2.2 glyA 基因的测序结果及编码序列分析
• 4.2.3 重组大肠杆菌BL21（pET-28a-glyA（S））和BL21（pET-28a-glyA（W））的构建
• 4.2.4 重组丝氨酸羟甲基转移酶蛋白的表达与纯化
• 4.2.5 苯甲醛标准曲线的绘制
• 4.2.6 丝氨酸羟甲基转移酶活力的测定与分析
• 4.3 本章小结
• 第五章 结论与展望
• 5.1 主要结论
• 5.2 论文工作的不足及今后工作的展望
• 致谢
• 参考文献
• 附录1：作者在攻读硕士学位期间发表的论文
• 附录2：化学计量方程式
• 附录3
• 1、细菌SYPS-062 的165 RDNA 基因的核苷酸序列
• 2、C.GLUTAMICUM SYPS-062 的GLYA 基因的核苷酸序列
• 3、C.GLUTAMICUM SYPS-062 的GLYA 基因编码蛋白的氨基酸序列
• 4、C.GLUTAMICUM ATCC13032 的GLYA 基因的核苷酸序列
• 5、C.GLUTAMICUM ATCC13032 的GLYA 基因编码蛋白的氨基酸序列