酵母转醛醇酶2晶体结构与功能研究及钩端螺旋体DDG醛缩酶初步晶体学研究

论文摘要

醛缩酶是一类裂解酶,狭义的醛缩酶指的是1,6-二磷酸-D-果糖醛缩酶（EC4.1.2.13）,它可以催化裂解1,6-二磷酸-D-果糖,生成3-磷酸-D-甘油醛和α-二羟丙酮磷酸这样一个可逆的醛醇缩合裂解反应。而广义的醛缩酶包括很多催化同类型反应的酶,本论文中研究的转醛醇酶（转二羟丙酮基酶）（EC 2.2.1.2）和2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶（EC 4.1.2.20）都属于醛缩酶家族。醛缩酶参与糖酵解过程,可以高效地催化酮对受体醛的立体选择性加成,即催化代谢物质C-C键的形成与断裂,而C-C键的立体选择性形成是有机合成化学领域的一个重要反应。所以,醛缩酶作为一种很有前景的生物合成剂被广为研究和应用。根据催化性质的差异,可以把醛缩酶分为两个类型:Ⅰ型醛缩酶和Ⅱ型醛缩酶。前者主要存在于高等植物以及动物中,该型醛缩酶酶活能力的发挥需要在酶的核心结构的一个赖氨酸（Lysine）残基形成Schiff碱中间体;后者主要存在于细菌和真菌中,在其催化过程中,需要二价金属阳离子在其活性部位作为辅因子发挥作用。转醛醇酶属于Ⅰ型醛缩酶,在糖代谢戊糖磷酸途径的非氧化阶段能够可逆的催化景天庚酮糖-7-磷酸的二羟丙酮部分转移给甘油醛-3-磷酸,生成果糖-6-磷酸和赤藓糖-4-磷酸。酵母基因组的一个开放阅读框NQM1/YGR043C编码的一段氨基酸序列运用COG数据库分析认为是一个转醛醇酶,但是关于这个基因目前为止还没有任何直接的实验证据。本课题的目的就是希望了解它并证明它是否是一个转醛醇酶。2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶属于Ⅱ型醛缩酶,能够可逆的催化2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸分裂成丙醇二酸半醛和丙酮酸。作为丙酮酸代谢途径中非常重要的酶,钩端螺旋体2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶被当成抗钩端螺旋体病的生物制剂的一种靶蛋白而备受重视。（一）关于NQM1/YGR043C的课题,我们从酵母基因组中克隆出了该基因,并成功构建其pET22b（+）和pET28a载体的表达质粒;表达并纯化了此重组蛋白;利用转醛醇酶酶活实验证实了其确实存在转醛醇酶活性;利用悬滴气相扩散法筛选出了NQM1/YGR043C晶体的初步生长条件,通过优化最终获得了适于X-ray衍射的晶体;在北京同步辐射收集了一套1.9（?）的常规数据,空间群为I2l2l2l,晶胞参数为a=85.03（?）,b=113.46（?）,c=158.92（?）,α=β=γ=90°;利用分子置换方法解析出了NQM1/YGR043C晶体的衍射相位,并通过模型构建和精修获得了1.9（?）分辨率的最终结构模型。NQM1/YGR043C核心结构是一个非常保守的（α/β）8桶,8个扭曲的平行的βstrand（β1-8 strand）排列在一起组成一个很像啤酒桶的结构内核,连接这些彼此平行的βstrand的7个α螺旋（α2-8螺旋,缺失α1螺旋）缠绕在桶的外沿,另外,在核心的（α/β）8桶外周还围绕着7个α螺旋（αA-G螺旋）。分析NQM1/YGR043C与同源转醛醇酶的氨基酸序列和二级结构分布,所有转醛醇酶亚家族的特征性高度保守的残基都能在NQM1/YGR043C中发现。比较NQM1/YGR043C与同源转醛醇酶（人源转醛醇酶和大肠杆菌转醛醇酶B）的三维结构,证实其和同源物之间不仅具有非常相似的整体结构和核心的（α/β）8桶结构。而且所有关键的活性相关的氨基酸残基,位置和构象都保持了高度的一致。另外在TAL2YEAST（NQM1/YGR043C）晶体结构的表面发现了文献报道中提到的转醛醇酶的可能的底物传递通道,这一通道从Ser173残基直至Lys144残基,主要由β4、β5 strand及紧随β5 strand的一段loop上的若干氨基酸残基组成。综上实验发现和证据,证实NQM1/YGR043C编码的确实是一个转醛醇酶,TAL2 YEAST,另外还推断了TAL2 YEAST与其同源酶相似的催化过程。（二）关于钩端螺旋体2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶,我们从含有目的基因的质粒中克隆出了编码钩端螺旋体DDG醛缩酶的基因,并成功构建其pET22b（+）载体的表达质粒;表达并纯化了钩端螺旋体DDG醛缩酶蛋白;利用悬滴气相扩散法筛选出了钩端螺旋体DDG醛缩酶晶体的初步生长条件,并通过优化获得了分辨率高于3（?）的晶体;利用金属离子和甘油浓度梯度筛选出合适的冷冻保护策略,提高了钩端螺旋体DDG醛缩酶晶体耐受X-Ray的能力,足以收取完整的数据;在实验室常规光源收集了一套2.2（?）的常规数据,晶体空间群类型属于C2,晶胞参数为a=293.5（?）,b=125.6（?）,c=87.6（?）,α=γ=90°,β=100.9°,并利用分子置换方法得到了一个初步的相位。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第一篇 酵母源转醛醇酶2的晶体结构及其酶活性质鉴定
• 第一章 综述 转醛醇酶的结构功能研究现状
• 第一节 醛缩酶简介
• 第二节 转醛醇酶简介
• 第三节 转醛醇酶结构生物学研究现状
• 第四节 NQM1/YGR043C简介
• 第二章 实验材料、设备和方法
• 第一节 实验材料与设备
• 2.1.1 菌株、质粒和培养基
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 第二节 实验方法
• 2.2.1 溶液的配置
• 2.2.2 目的基因的重组克隆质粒构建
• 2.2.2.1 引物设计
• 2.2.2.2 聚合酶链式反应扩增目的基因
• 2.2.2.3 回收PCR产物
• 2.2.2.4 培养基配制
• 2.2.2.5 大肠杆菌感受态细胞DH5α和BL21（DE3）的制备
• 2.2.2.6 载体pET-22b（+）、pET-28a的中量制备
• 2.2.2.7 载体与PCR产物的双酶切反应、琼脂糖凝胶电泳回收
• 2.2.2.8 载体与目的基因双酶切产物的连接
• 2.2.2.9 连接产物的转化
• 2.2.2.10 质粒的提取与转化子的筛选和鉴定
• 2.2.3 目的蛋白的表达和纯化
• 2.2.3.1 重组质粒转化大肠杆菌BL21（DE3）感受态细胞
• 2.2.3.2 重组蛋白表达情况鉴定
• 2.2.3.3 目标蛋白的大量表达
• 2.2.3.4 蛋白纯化
• 2.2.4 蛋白理化性质研究
• 2.2.4.1 蛋白质浓度测定（pierce公司BCA Protein Assay Kit）
• 2.2.4.2 应用凝胶层析法判断蛋白在溶液中的聚集状态
• 2.2.4.3 蛋白转酫醇酶活性鉴定
• 2.2.5 晶体生长与数据收集
• 2.2.6 晶体结构解析与分析
• 第三章 结果与讨论
• 第一节 NQM1/YGR043C全长片段的重组质粒构建
• 3.1.1 引物设计
• 3.1.2 目的基因的PCR反应
• 3.1.3 重组质粒的鉴定
• 第二节 NQM1/YGR043C在E.Coli.中的表达与纯化
• 3.2.1 目的蛋白在原核表达系统中的表达情况
• 3.2.2 目的蛋白的纯化和浓缩
• 3.2.3 目的蛋白相关理化性质的判定
• 第三节 NQM1/YGR043C的转醛醇酶活性鉴定
• 3.3.1 转醛醇酶活性测定体系
• 3.3.2 NQM1/YGR043C蛋白的转醛醇酶活性鉴定
• 第四节 NQM1/YGR043C的初步晶体学研究
• 3.4.1 NQM1/YGR043C的晶体筛选和优化
• 3.4.2 衍射数据收集和数据处理
• 第五节 晶体结构解析和结构模型的质量分析
• 3.5.1 NQM1/YGR043C蛋白晶体的结构解析
• 3.5.2 NQM1/YGR043C蛋白结构模型质量分析
• 3.5.2.1 模型与电子云密度的吻合情况
• 3.5.2.2 温度因子分布
• 3.5.2.3 立体化学分析
• 3.5.2.4 原子间的范德华接触
• 第六节 NQM1/YGR043C整体结构
• 第七节 结构分析与讨论
• 3.7.1 二聚体作用
• 3.7.2 与其它转醛醇酶的比较
• YEAST的催化方式'>3.7.3 TAL2_YEAST的催化方式
• 第八节 本篇小结
• 参考文献
• 第二篇 钩体2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶初步晶体学研究
• 第一章 综述
• 第一节 钩端螺旋体和钩端螺旋体病
• 第二节 2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶简介
• 1.2.1 2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶的研究现状
• 1.2.2 钩端螺旋体2-脱氢-3-脱氧葡糖二酸醛缩酶
• 第二章 实验材料、设备和方法
• 第一节 实验材料和设备
• 2.1.1 菌株、质粒和培养基
• 2.1.2 酶与试剂
• 2.1.3 仪器设备
• 第二节 试验方法
• 2.2.1 目的基因的重组克隆质粒构建
• 2.2.1.1 设计引物（Nde Ⅰ和Xho Ⅰ酶切位点）;
• 2.2.1.2 聚合酶链式反应,PCR产物胶回收:
• 2.2.1.3 目的基因和载体（pET22b（+））的双酶切;
• 2.2.1.4 载体和目的基因双酶切产物的连接;
• 2.2.1.5 连接产物的转化
• 2.2.1.6 质粒的提取与转化子的筛选和鉴定
• 2.2.2 目的蛋白的表达和纯化
• 2.2.2.1 重组蛋白表达情况鉴定
• 2.2.2.2 目标蛋白的大量表达和纯化
• 2.2.3 晶体生长与数据收集
• 第三章 结果与讨论
• 第一节 钩端螺旋体DDG醛缩酶全长片段的重组质粒构建
• 3.1.1 引物设计
• 3.1.2 目的基因的PCR反应
• 3.1.3 重组质粒的鉴定
• 第二节 钩端螺旋体DDG醛缩酶在E.Coli.中的表达与纯化
• 3.2.1 目的蛋白在原核表达系统中的表达情况
• 3.2.2 目的蛋白的纯化和浓缩
• 第三节 钩端螺旋体DDG醛缩酶的初步晶体学研究
• 3.3.1 钩端螺旋体DDG醉缩酶晶体的筛选和优化
• 3.3.2 衍射数据的收集
• 第四节 本篇小结
• 参考文献
• 附录
• pET22b（+）载体图谱
• pET28a载体图谱
• 致谢
• 学习研究经历和在读期间发表的学术论文