论文题目: PRRSV GP4和GP5多表位串联基因的表达及在小鼠诱导的免疫反应
论文类型: 博士论文
论文专业: 预防兽医学
作者: 付利芝
导师: 杨汉春
关键词: 猪繁殖与呼吸综合征病毒,多表位串联,小鼠,免疫反应
文献来源: 中国农业大学
发表年度: 2005
论文摘要: 猪繁殖与呼吸综合征是由猪繁殖与呼吸综合征病毒(porcine reproductive and respiratory syndrome, PRRSV)引起的一种以母猪繁殖障碍和仔猪呼吸道疾病为主要特征的传染病。本研究采用重叠区扩增基因拼接法(gene splicing by overlap extension, SOEing)构建出两个含有PRRSV GP5和GP4优势抗原表位核苷酸片段的多表位串联基因,分析其真核表达重组质粒和原核表达产物在小鼠诱导的免疫反应。 采用SOEing PCR的方法将编码GP5的aa29～60和GP4的aa33～70核苷酸片段进行拼接,获得两个编码双表位多串联基因E54-2和E54-4。将E54-2和E54-4基因分别克隆至pcDNA3.1(+),构建出真核表达重组质粒pcDNA3-E54-2、pcDNA3-E54-4。采用SOEing PCR将E54-2基因与猪泛素基因(Ubiquiten)融合,获得融合基因Ub-E54-2,构建出真核重组表达质粒pcDNA3Ub-E54-2。将3种真核重组质粒分别转染COS7细胞,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4分别转染P815细胞,间接免疫荧光试验表明,重组质粒在哺乳动物细胞中能瞬时和稳定表达目的蛋白E54-2和E54-4。 将E54-2和E54-4基因克隆至原核表达载体pGEX-6P-1,构建原核表达重组质粒pGEX-6P-E54-2和pGEX-6P-E54-4,经在大肠杆菌中诱导表达,蛋白表达量分别为40%和30%。采用包涵体洗涤和电洗脱纯化重组蛋白GST-E54-2和GST-E54-4。Western-Blotting分析结果表明,重组蛋白可与猪源PRRSV阳性血清和鼠源的抗GP4和GP5血清发生特异性反应。 用3种真核表达重组质粒分别免疫小鼠,结果表明,3种真核表达重组质粒均能诱导体液免疫反应,产生特异性的抗GP4、GP5和多表位串联肽抗体。在首免后第28天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组和对照组之间抗GP5抗体水平差异显著(p<0.05);首免后第49天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组之间抗GP5抗体差异显著(p<0.05);在首免后第28天,pcDNA3-E54-2和pcDNA3-E54-4免疫组和对照组之间抗GP4抗体水平差异显著(p<0.05)。4免后3周,pcDNA3-E54-2免疫组中和抗体效价为1:16,pcDNA3-E54-4免疫组中和抗体效价为1:28。 用纯化的融合蛋白GST-E54-2、GST-E54-4和表达GST-E54-2和GST-E54-4融合肽的基因工程全菌体分别免疫小鼠。经ELISA检测结果表明,在3免后1周,E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗GP4和GP5抗体效价分别为1:1,600和1:3,200;E54-4全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗GP4抗体效价为1:3,200,抗GP5抗体效价分别为1:12,800和1:6,400。中和抗体检测结果表明,在3免后1周,E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组抗体效价分别为1:22.2和1:19.9;E54-4全菌免疫组和E54-4纯化蛋白免疫组抗体效价为1:45.7和1:33.9,高于E54-2全菌免疫组和纯化蛋白免疫组。 综上结果表明,构建的PRRSV GP4、GP5多表位真核重组表达质粒在小鼠体内可诱导特异性抗体产生,原核表达的GP4、GP5多表位串联肽具有良好的免疫原性,有开发成疫苗的潜在价值。
论文目录:
摘要
ABSTRACT
插图与附表清单
缩略词表
第一章 引言
1.1 国内外研究概况
1.2 研究目的与意义
1.3 研究内容与技术路线
1.4 研究目标
第二章 PRRSV GP5和GP4多表位基因串联及真核重组质粒的构建
2.1 引言
2.2 材料与方法
2.3 结果与分析
2.4 讨论
2.5 小结
第三章 PRRSV GP4和GP5多表位串联肽的原核表达与纯化
3.1 引言
3.2 材料与方法
3.3 结果与分析
3.4 讨论
3.5 小结
第四章 表达PRRSV GP4和GP5多表位串联肽真核重组质粒在小鼠诱导的免疫反应
4.1 引言
4.2 材料与方法
4.3 结果与分析
4.4 讨论
4.5 小结
第五章 原核表达PRRSV GP4和GP5多表位串联肽在小鼠体内的免疫反应
5.1 引言
5.2 材料与方法
5.3 结果与分析
5.4 讨论
5.5 小结
第六章 结论
第七章 创新点
第八章 文献综述
8.1 表位的研究状况
8.2 表位疫苗的研究
8.3 提高表位疫苗的免疫效果措施
参考文献
致谢
作者简介
发布时间: 2005-07-18
参考文献
- [1].猪繁殖与呼吸综合征病毒免疫调节功能基因解析与GP5糖基化位点缺失病毒免疫特性研究[D]. 刘星.南京农业大学2015
- [2].猪繁殖与呼吸综合征病毒N、GP5蛋白的表达、纯化及结构分析[D]. 黄金海.中国农业大学2004
- [3].蛋白激酶C对PRRSV感染的影响以及GP5重组乳酸克鲁维酵母免疫效果的初步研究[D]. 赵海艳.中国农业大学2014
- [4].RNAi靶向PRRSV N基因及GP5基因ADE表达缺失重组腺病毒免疫原性研究[D]. 杨闽楠.吉林大学2014
相关论文
- [1].猪繁殖与呼吸综合征病毒BJ-4株感染性分子克隆的构建[D]. 陈小云.中国农业大学2004
- [2].PRRSV-SCQ株结构基因生物信息学及人工感染仔猪病理变化与超微结构研究[D]. 颜其贵.四川农业大学2005
- [3].猪繁殖与呼吸综合征病毒结构蛋白单克隆抗体的制备及其抗原表位的鉴定[D]. 周艳君.东北农业大学2005
标签：猪繁殖与呼吸综合征病毒论文; 多表位串联论文; 小鼠论文; 免疫反应论文;