ISSR标记在植物遗传分析中的应用研究 ——以蝴蝶兰、橄榄、木槿属植物为例

论文摘要

ISSR（Inter Simple Sequence Repeat）分子标记是一种以微卫星序列为引物,进行多位点PCR扩增的技术。引物的设计无需预知基因组序列,就能用来扩增两个序列相同但方向相反微卫星序列之间的DNA片段,前提是这段区域的长度在可扩增范围内。ISSR技术简单快速,并且同时具备AFLP（扩增酶切片段多态性）、SSR（简单序列重复）和RAPD（随机扩增多态性）等分子标记方法的一些优点。ISSR标记凭借其高度多态性和快速简易性,被越来越广泛的应用于植物研究中,特别是遗传关系和遗传多样性的研究。为了探讨ISSR技术在植物研究中的应用潜力,本研究分别对59个蝴蝶兰（Phalaenopsis）品种、22份橄榄（Canarium）种质资源以及5个木槿属（Hibiscus）植物进行了ISSR分析,主要实验结果如下:1、分别改进了不同植物基因组DNA的提取方法:用FastPrep法提取蝴蝶兰基因组DNA,使得多样品DNA提取变得省时省力;针对橄榄和木槿属植物富含多酚和多糖等物质的问题,运用改进方法可提取到适用于ISSR-PCR扩增的基因组DNA。2、对蝴蝶兰的ISSR-PCR反应体系进行了单因素梯度优化,对橄榄的ISSR-PCR反应体系进行了正交优化,结果表明两种方法都是有效的,但是正交试验更加简易快速。根据蝴蝶兰和橄榄的反应体系,对个别因素稍做调整就可得到木槿属植物的最适反应体系。可见,不同植物间的ISSR-PCR反应体系具有一定的通用性。3、研究结果显示,对于每种植物都能得到足够的ISSR信息位点用于遗传分析,且多态性条带比率较高,证明ISSR技术适用于蝴蝶兰、橄榄和木槿属植物的研究。另外,对于每种植物都检测到了数量可观的特异性条带,可见ISSR标记在植物品种鉴定方面具有很大的应用潜力。4、对蝴蝶兰进行ISSR分析,用14个筛选到的引物共扩增出了192条带,多态性条带比率为85.9 %。59个品种的遗传距离在0.035～0.386之间,大部分品种间的遗传距离普遍较小,而少数外引品种则表现出显著的遗传分化。14个引物组合就能区分所有59个品种,并且检测到了35条特异性条带,可用来鉴定供试蝴蝶兰中的20个品种。UPGMA聚类分析表明,聚类结果与花色特征比较一致,但与花色的划分结果并不完全相同。5、对橄榄进行ISSR分析,用8个筛选到的引物共扩增出了164条带,多态性条带比率为77.4 %。21个橄榄品种的遗传距离只有0.048～0.138,可以看出它们的遗传多样性不高,说明品种间的遗传分化不大。另外,8个引物组合就能区分所有21个橄榄品种,并且检测到了11条特异性条带,可用来鉴定供试橄榄中的8个品种。6、对木槿属植物ISSR分析,用5个筛选到的引物共扩增出66条带,多态性条带比率为72.7 %。从遗传距离树状图可知,裂瓣槿和扶桑的四个栽培变种之间遗传相似性较高,这个结果进一步支持了“裂瓣槿归为扶桑的一个栽培变种”的观点。另外,通过对其中3个材料扩增条带的叠加性进行分析后,进一步证实了红色中玫槿可能是裂瓣槿和洋红中玫槿杂交种的推测。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩写说明
• 第1章 前言
• 1.1 遗传标记
• 1.1.1 形态标记（Morphological markers）
• 1.1.2 细胞学标记（Cytological markers）
• 1.1.3 蛋白质标记（Proteinic markers）
• 1.1.4 分子标记（Molecular markers）
• 1.2 ISSR分子标记技术
• 1.2.1 常用分子标记
• 1.2.2 ISSR分子标记技术的原理和特点
• 1.3 ISSR技术在植物研究中的应用
• 1.3.1 品种鉴定和种质资源收集
• 1.3.2 遗传多样性和系统进化关系
• 1.3.3 遗传作图、基因定位及标记辅助选择
• 1.3.4 短重复基序丰度预测及辅助设计SSR引物
• 1.4 蝴蝶兰及其研究进展
• 1.4.1 蝴蝶兰简介
• 1.4.2 分子标记在蝴蝶兰研究中的应用
• 1.5 橄榄及其研究进展
• 1.5.1 橄榄简介
• 1.5.2 橄榄的用途及经济价值
• 1.5.3 橄榄的研究进展
• 1.6 木槿属植物及其研究进展
• 1.6.1 木槿属植物简介
• 1.6.2 木槿属植物的研究进展
• 第2章 59 个蝴蝶兰遗传关系的ISSR分析
• 2.1 材料、试剂与器材
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 实验试剂
• 2.1.3 实验器材及耗材
• 2.2 实验方法及步骤
• 2.2.1 试剂准备
• 2.2.2 蝴蝶兰基因组DNA的提取和检测
• 2.2.3 ISSR-PCR实验条件优化
• 2.2.4 引物的筛选
• 2.2.5 ISSR-PCR反应及结果检测
• 2.2.6 条带统计及数据分析
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 蝴蝶兰基因组DNA的检测结果
• 2.3.2 ISSR-PCR扩增结果
• 2.3.3 蝴蝶兰的遗传距离聚类分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 FastPrep法提取蝴蝶兰DNA
• 2.4.2 ISSR-PCR的影响因素
• 2.4.3 ISSR技术应用于蝴蝶兰品种的鉴定
• 2.4.4 蝴蝶兰遗传关系的ISSR分析
• 第3章 22 份橄榄种质资源的ISSR分析
• 3.1 材料、试剂与器材
• 3.1.1 实验材料
• 3.1.2 实验试剂
• 3.1.3 实验器材及耗材
• 3.2 实验方法及步骤
• 3.2.1 试剂准备
• 3.2.2 橄榄基因组DNA的提取和检测
• 3.2.3 ISSR-PCR反应条件正交优化
• 3.2.4 引物的筛选
• 3.2.5 ISSR-PCR反应及结果检测
• 3.2.6 条带统计及数据分析
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 橄榄基因组DNA的检测结果
• 3.3.2 ISSR-PCR扩增结果
• 3.3.3 橄榄种质资源的遗传距离聚类分析
• 3.4 讨论
• 3.4.1 橄榄总DNA提取
• 3.4.2 ISSR-PCR反应条件的正交优化
• 3.4.3 ISSR技术应用于橄榄种质资源的鉴定
• 3.4.4 橄榄种质资源的ISSR分析
• 第4章 5 个木槿属植物亲缘关系的ISSR分析
• 4.1 材料、试剂与器材
• 4.1.1 实验材料
• 4.1.2 实验试剂
• 4.1.3 实验器材及耗材
• 4.2 实验方法及步骤
• 4.2.1 试剂准备
• 4.2.2 木槿属植物基因组DNA的提取和检测
• 4.2.3 ISSR-PCR反应条件正交优化
• 4.2.4 引物的筛选
• 4.2.5 ISSR-PCR反应及结果检测
• 4.2.6 条带统计及数据分析
• 4.3 结果与分析
• 4.3.1 木槿属基因组DNA的检测结果
• 4.3.2 ISSR-PCR扩增结果
• 4.3.3 木槿属植物的遗传距离聚类分析
• 4.4 讨论
• 4.4.1 DNA提取时去除多糖
• 4.4.2 5 个木槿属植物的亲缘关系
• 4.4.3 红色中玫槿、洋红中玫槿和裂瓣槿三种植物的DNA指纹图谱
• 第5章 结论与展望
• 5.1 结论
• 5.2 展望
• 参考文献
• 致谢