油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分析

论文摘要

“NDF-1”是利用快中子轰击及硫酸二乙酯（DES）联合处理甘蓝型油菜高秆品系，然后再自交纯合后育成的矮化突变体，其株高仅及亲本的三分之一。“NDF-1”在油菜抗倒伏及半矮秆杂交种选育中具有重要的作用。本文应用抑制性消减杂交（suppression subtractive hybridization，SSH）技术构建了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”茎段伸长初期的抑制性消减文库，对差异表达基因进行分析，为探究油菜矮化突变的分子机理及克隆该基因应用于油菜品种基因工程改良奠定基础。首先，应用SSH技术，以矮秆突变株系“NDF-1”为Tester、高秆野生型“3529”为Driver，构建了甘蓝型油菜矮化突变体“NDF-1”茎段伸长初期茎尖的抑制性消减文库。经菌落PCR检测，消减文库的有效重组率为58％，其中插入的cDNA片段大小在100 bp到500bp之间。通过斑点杂交对88个随机挑选的含有插入片段的阳性克隆进行初步差异筛选，然后选取了30个阳性克隆进行序列测定。除7个克隆未出现测序结果外，其余克隆均获得了DNA序列结果。对cDNA序列在GenBank数据库中进行同源性比较。其中13个有比较明确的比对结果：其中1个和信号转导有关，2个和植物抗病性有关，1个和蛋白质的泛素化降解有关，1个和脂肪酸转运有关；另外有8个克隆为功能未知的蛋白质。其次，在SSH文库克隆序列分析的基础上，以甘蓝型油菜（Brassica napus）矮化突变体“NDF-1”茎尖为材料提取RNA，采用RACE技术对编码几丁质酶基因的G6克隆的3’端片段进行了RACE扩增，获得3’端片段序列长度为344bp，在GenBank中进行比对（blast）分析。结果表明，与几丁质酶基因核苷酸和蛋白质同源性分别为86％和84％。根据G6克隆的已知序列设计特异引物并应用逆转录合成的cDNA和PCR技术，检测其在野生型与矮化突变体不同部位的差异表达。结果显示，该基因仅在矮化突变体茎尖部位有比较明显的表达；在矮化突变体根、茎、子叶和成熟叶片部位无表达；在野生型根、茎、茎尖、子叶和成熟叶片等部位均无表达或无明显表达。初步结果表明，该仅在茎尖表达的基因很可能和矮化突变体的矮化有关。为了进一步研究该基因在甘蓝型油菜茎秆发育中的作用及参与矮化形成的具体机理，还有待克隆其cDNA全长，通过遗传转化分析其在矮化突变体中的功能。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 油菜矮化突变体茎段伸长初期茎尖差异表达基因的初步分析
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 菌株和载体
• 2.1.3 试剂和工具酶
• 2.2 方法
• 2.2.1 总RNA的提取
• 2.2.2 mRNA的分离和纯化
• 2.2.3 抑制性削减杂交
• 2.2.4 消减文库的构建
• 2.2.5 斑点杂交筛选
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA和mRNA的提取
• 3.2 削减效率的检测
• 3.3 消减cDNA文库的构建
• 3.4 消减文库阳性克隆的检测
• 3.5 斑点杂交结果
• 3.6 测序结果的比较与分析
• 3.7 部分基因的功能分析
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 第二章 BnG6基因3'端RACE及其在野生型“3529”与矮化突变体“NDF-1”不同部位的差异表达
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1 材料
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 其他材料与试剂
• 2.2 实验方法和步骤
• 2.2.1 总RNA提取
• 2.2.2 cDNA第一链合成
• 2.2.3 3'端RACE
• 2.2.4 RT-PCR引物的设计
• 2.2.5 半定量PCR
• 3 结果与分析
• 3.1 总RNA电泳检测
• 3.2 3'端RACE
• 3.3 半定量RT-PCR
• 4 讨论
• 5 小结
• 参考文献
• 植物差异表达基因的研究方法
• 1 mRNA差异显示技术
• 1.1 基本原理
• 1.2 mRNA差异显示技术的优、缺点和发展
• 1.2.1 反转录模板
• 1.2.2 引物的改进
• 1.2.3 酶的使用
• 1.2.4 降低dNTP浓度
• 1.2.5 选择最适的反转录退火温度
• 1.2.6 PCR程序参数的改进
• 1.2.7 产物展示
• 1.3 mRNA差异显示技术的应用
• 1.3.1 筛选和克隆目的基因，开展转基因育种
• 1.3.2 探讨雄性不育的机理
• 2 cDNA代表性差示分析技术
• 2.1 RDA的原理和技术方法
• 2.2 RDA的优点及存在的问题
• 2.3 RDA的应用
• 3 cDNA微阵列技术
• 3.1 cDNA微阵列技术的原理与方法
• 3.2 cDNA微阵列技术的优点与局限性
• 3.3 cDNA微阵列技术的应用
• 4 基因表达系列分析技术
• 4.1 SAGE的原理和实验方法
• 4.2 SAGE的优、缺点及改进方法
• 4.3 SAGE的应用
• 5 抑制性消减杂交技术
• 5.1 抑制性消减杂交的原理与步骤
• 5.2 SSH技术的优越性和主要缺陷
• 5.3 SSH技术的应用进展
• 6 小结
• 参考文献
• 在读硕士期间发表论文情况
• 致谢