拟黑多刺蚁CREB基因的克隆与原核表达

论文摘要

CREB是一种重要的核转录调控因子,为bZIP家族成员之一。它的单体从N端到C端主要包括激酶诱导域（KID）、碱性区（basic region）和亮氨酸拉链模体（leucine zipper motif）。CREB受多种信号转导通路的调控,除了经典的cAMP调控通路外,还有Ras-Raf-MAPK通路、Ca2--CaMK通路和应激相关的P38通路等。活化的CREB需同辅激活因子CBP相结合,才能激活转录发生。CREB为管家基因的产物,功能广泛而复杂,如参与学习记忆、诱导癌细胞凋亡、对胚胎发育具有不可缺的作用等。拟黑多刺蚁（polyrhachis vicina roger）是一类营群居而且分工明确的社会性昆虫,同时也是一类重要的资源昆虫。本研究以拟黑多刺蚁为研究材料,采用RT-PCR、5’与3’RACE技术,克隆分离出了CREB基因,对该基因进行序列分析和功能预测。并构建了该基因的原核表达载体,转化大肠杆菌BL21,经IPTG诱导表达,SDS-PAGE电泳检测分析,结果表明重组质粒能在大肠杆菌中表达。具体结果如下:1、基因克隆:从拟黑多刺蚁中提取总RNA,根据已报道的昆虫CREN核苷酸序列的保守区域设计简并引物,利用RT-PCR技术获得471bp该基因的保守序列,然后根据该保守序列设计特异性引物,利用RACE技术获得CREB基因cDNA全长,并命名为PVCREB。PvCREB基因全长为1154bp,包含一个762bp的开放阅读框、55bp的5’-UTR和337bp的3’-UTR,它编码一个全长为253个氨基酸的蛋白质,分子量27.5649KD,理论等电点PI为6.98。将PvCREB基因核苷酸序列上传Genebank,序列号为:EU523223。2、序列分析:PvCREB与蜜蜂、家蚕、拟古盗和伊蚊的CREB蛋白质氨基酸序列相似性分别为90.8%、65.8%、75.1%和55.8%,它甚至与现代人类的CREB氨基酸序列一致性为46.7%。基于NJ法构建的进化树显示,PvCREB与蜜蜂的CREB形成一支,与所有已知的昆虫CREB聚在一起。该基因蛋白具有一段核定位序列RKRELRLLKNREAARECRRKKKE,经分析表明该蛋白定位在细胞核中,这与其在核内发挥转录调节功能相一致。PvCREB含有2个N型糖基化位点、1个cAMP磷酸化位点、4个蛋白激酶C磷酸化位点、8个酪蛋白激酶Ⅱ磷酸化位点、3个肉豆蔻酰基化位点、1个亮氨酸拉链位点,这些位点提供了蛋白质的功能信息。用Hopfield神经网络（HNN）对PvCREB蛋白质的二级结构预测结果表明,CREB的二级结构主要以α-螺旋,不规则盘绕和延伸链为蛋白最大量的结构元件,β-折叠散布于整个蛋白质中。采用SwissModel FirstApproach Mode对pvCREB蛋白的三级结构预测表明,pvCREB的bZIP1区结构与家鼠（Musmusculus）MmCREB的bZIP1结构非常相似,都由一个α-螺旋构成,差别是在α-螺旋区比模板多了3个螺旋环。3、原核表达:将分离得到的拟黑多刺蚁CREB基因的编码序列插入到原核表达载体PGEX-5X-1中,构建重组原核表达载体PGEX-5X-1/CREB,并转化到表达宿主菌BL21中。SDS-PAGE电泳显示其转化菌经IPTG诱导表达出大小为27KD左右的蛋白,与预测的拟黑多刺蚁CREB蛋白大小一致。本实验成功克隆并表达了拟黑多刺蚁CREB,为下一阶段拟黑多刺蚁CREB蛋白功能及其应用的研究奠定了基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第1章 绪论
• 1.1 拟黑多刺蚁概述
• 1.1.1 拟黑多刺蚁的品级与分工
• 1.1.2 拟黑多刺蚁的生境与发育
• 1.1.3 拟黑多刺蚁的研究意义及现状
• 1.2 CREB概述
• 1.2.1 CREB的发现
• 1.2.2 CREB的分子结构
• 1.2.3 CREB家族
• 1.2.4 CREB参与转录调控的作用机制及其功能的特异性
• 1.2.5 CREB的生理功能
• 1.2.6 CREB的研究现状
• 1.3 本研究的目的与意义
• 1.4 研究的内容
• 1.4.1 拟黑多刺蚁CREB基因全长cDNA克隆与序列分析
• 1.4.2 CREB基因在大肠杆菌中的表达
• 1.5 研究的技术路线
• 第2章 拟黑多刺蚁CREB基因全长cDNA的克隆与序列分析
• 2.1 材料
• 2.1.1 实验材料
• 2.1.2 菌株与质粒
• 2.1.3 主要试剂
• 2.1.4 主要仪器
• 2.1.5 常用的生物信息分析的相关软件及网站
• 2.2 方法
• 2.2.1 引物的设计与合成
• 2.2.2 拟黑多刺蚁总RNA的提取及检测
• 2.2.3 目的基因保守区域的获得
• 2.2.4 CREB基因3'端的扩增（3'RACE）
• 2.2.5 CREB基因5'端的扩增（5'RACE）
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 RNA抽提
• 2.3.2 拟黑多刺蚁CREB基因全长cDNA的克隆
• 2.3.3 拟黑多刺蚁CREB的生物信息学分析
• 2.4 讨论
• 2.4.1 拟黑多刺蚁CREB基因的克隆
• 2.4.2 拟黑多刺蚁CREB的生物信息学分析
• 第3章 拟黑多刺蚁CREB基因的原核表达
• 3.1 试验材料
• 3.1.1 菌株与载体
• 3.1.2 主要工具酶和试剂
• 3.1.3 主要试剂配制
• 3.1.4 主要仪器
• 3.2 方法
• 3.2.1 原核表达载体PGEX-5X-1/CREB的构建
• 3.2.2 目的基因ORF的制备
• 3.2.3 目的基因与PGEX-5X-1载体大片段的连接
• 3.2.4 重组质粒PGEX-5X-1/CREB的双酶切鉴定
• 3.2.5 重组质粒插入片段的全序列测定
• 3.2.6 重组质粒转化BL21感受态细胞
• 3.2.7 诱导表达
• 3.3 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 3.4 结果与分析
• 3.4.1 表达质粒PGEX-5X-1的提取与双酶切鉴定
• 3.4.2 CREB基因ORF的扩增与双酶切鉴定
• 3.4.3 重组质粒的PCR鉴定和双酶切鉴定
• 3.4.4 拟黑多刺蚁CREB基因在大肠杆菌中的表达
• 3.4.5 目的蛋白的可溶性分析
• 3.5 讨论
• 3.5.1 表达系统及表达载体的选择
• 3.5.2 影响融合蛋白表达的因素
• 3.5.3 拟黑多刺蚁CREB的原核表达
• 第4章 总结
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间的研究成果