鲆鲽鱼类变态时期相关基因的克隆与分析

论文摘要

鲆鲽鱼类与其他硬骨鱼类最明显的区别是脊椎的不对称性:两个眼睛都位于身体的一侧（有眼侧）。这一脊椎的不对称性的变化发生在鲆鲽鱼类的变态时期。变态时,鲆鲽鱼类的一只眼睛从一侧偏转到另一侧,由脊椎对称的浮游性鱼类发育成脊椎不对称的底栖型鱼类,同时也发生了很多其他形态学和生理学变化。但是,导致鲆鲽鱼类变态及眼睛偏转方向的分子机制一直没有定论。左偏的牙鲆与右偏石鲽的杂交子代基于相同的遗传背景且在变态时眼睛向不同方向偏转,成为了研究鲆鲽鱼类变态和眼睛偏转方向的难得的实验材料。本实验运用了差异显示技术（DDRT-PCR）和代表性差异杂交（RDA）两种基因筛选方法用来筛选变态前期的左偏和右偏杂交种中差异表达的基因,分别筛选出23和47个片段。实验结果显示RDA是基因筛选的可行方法之一。大部分的片段与眼睛偏转方向都没有直接关系,但是RDA筛选出的肌肉型肌酸激酶1（CK-M1）和胰蛋白酶原前体2（TR2P）经检验与鲆鲽鱼类的变态有关。肌肉型肌酸激酶1作为催化能量产生的重要催化剂之一,从变态前与变态前期的牙鲆仔鱼的RDA实验中筛选出经克隆测序,得到全序列。其序列与其他鱼类和哺乳动物的CK-M1的相似性很高。在牙鲆成鱼中,CK-M1在各个组织中都有较高的表达,特别是肌肉,内脏和鳃中。整体原位杂交和实时定量PCR结果显示CK-M1在变态期间的牙鲆仔鱼中的表达情况与变态紧密相关,随着变态的开始增加到高峰,之后下降,变态结束后,其表达量也下降到与变态前一样的水平。这些可以说明,CK-M1与牙鲆仔鱼的变态过程有着密切的关系。胰蛋白酶原前体2是动物消化道中由胰腺细胞分泌的重要的消化酶之一。从牙鲆与石鲽杂交种的RDA实验中筛选出经分别在牙鲆和石鲽中克隆测序,分别得到全序列。其序列与其他鱼类的TR2P的相似性较高。在牙鲆成鱼中,TR2P在各个组织中都有表达,在肠道中的表达量最高。实时定量PCR结果显示TR2P在变态期间的牙鲆仔鱼中的表达情况与变态紧密相关,随着变态的开始突增,之后稍有下降,但一直维持高于变态前仔鱼的表达量直到变态完毕。可以说明,TR2P与牙鲆仔鱼的变态过程有着密切的关系。而且,RDA右偏库中筛选出的TR2P片段与同是右偏的父本石鲽的TR2P之间相似性高于与母本牙鲆,猜测其与鲆鲽鱼类的眼睛偏转方向相关。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 第一章 文献综述
• 第一节 鲆鲽鱼类的变态及相关机制
• 1.动物变态类型概况
• 2.鲆鲽鱼类的变态
• 2.1.形态学
• 2.1.1.眼睛的偏转
• 2.1.2.冠状幼鳍的消长
• 2.1.3.体色的左右不对称
• 2.1.4.颅脑的扭转
• 2.1.5.血红细胞的变化
• 2.1.6.骨骼肌的变化
• 2.1.7.胃的变化
• 2.2.生态习性的变化
• 3.鲆鲽鱼类变态时期的划分
• 4.鲆鲽鱼类的变态机制
• 4.1.甲状腺激素在鲆鲽鱼类变态中的作用
• 4.2.甲状腺激素作用机制
• 4.3.其他激素对鲆鲽鱼类变态的影响
• 4.4.外源因子对鲆鲽鱼类变态的影响
• 4.5.鲆鲽鱼类变态的分子机制
• 第二节 鲆鲽杂交
• 第三节 基因筛选方法
• 1.差异显示技术
• 2.cDNA代表性差异分析
• 第二章 筛选牙鲆×石鲽（Paralichthys olivaceus×Kareius bicoloratus）杂交种中与变态相关的基因
• 0.前言
• 1.材料
• 1.1.实验材料
• 1.2.工具酶、试剂盒和引物
• 2.实验方法
• 2.1 总RNA提取（Trizol法）
• 2.2.总RNA中DNA的消除
• 2.3.DD-RT-PCR
• 2.4.cDNA-RDA
• 2.5.目的片段的克隆,测序
• 2.6.Northern杂交检测片段
• 2.7.Northern点杂交
• 2.8.差异片段的RT-PCR验证
• 3.结果
• 3.1 DDRT-PCR
• 3.2 cDNA-RDA
• 3.2.1 RDA结果
• 3.2.2 WAVE系统检测杂交产物
• 3.2.3 差减库片段的回收与测序
• 3.2.4 Northern点杂交
• 3.2.5 Northern杂交结果
• 4.讨论
• 第三章 肌酸激酶（creastinekinase,CK）的克隆与牙鲆变态时期的表达研究
• 1.材料
• 2.方法
• 2.1.RNA提取
• 2.2 cDNA的合成
• 2.3 RDA
• 2.4 特异片段的克隆
• 2.5 基因全长cDNA序列的获得
• 2.6.整体原位杂交
• 2.7.实时定量PCR（Real-time PCR）
• 3.结果
• 3.1.RDA分离得到的CK-M1序列
• 3.2.牙鲆CK-M1全序列的克隆
• 3.3.整体原位杂交
• 3.4.实时定量PCR
• 4.讨论
• 第四章 牙鲆胰蛋白酶原前体2 Trypsinogen 2 precursor（TR2P）的克隆与表达初步分析
• 1.材料
• 2.实验方法
• 2.1.RNA提取
• 2.2.cDNA的合成
• 2.3.RDA
• 2.4.特异片段的克隆
• 2.5.基因全长cDNA序列的获得
• 2.6.实时定量PCR（Real-time PCR）
• 3.结果
• 3.1.RDA筛选得到的TR2P序列
• 3.2.TR2P在牙鲆和石鲽中的全长扩增
• 3.3.牙鲆TR2P在各个组织和变态期间的实时定量PCR
• 3.4.牙鲆、石鲽与杂交子代TR2P之间的比较
• 4.讨论
• 参考文献
• 致谢
• 个人简历
• 发表及待发表的学术论文