论文摘要
双生病毒是植物病毒中唯一一类具有孪生颗粒形态的单链DNA病毒,已在多个国家和地区的多种重要经济作物上造成毀灭性危害。在我国的云南、广东、广西、海南和台湾等地的作物及杂草上已相继发现了多种双生病毒。为进一步了解双生病毒在我国的种类、分布及危害,本论文对我国上海、广东和广西地区发生的双生病毒进行了分子鉴定及致病性研究。从上海孙桥农场采集了2份表现为黄曲叶症状的番茄样品（SH1和SH2）,利用双生病毒特异性引物PA/PB扩增得到约500 bp片段的相似性为97.4%。随机选择SH2进行全序列测定（登录号AM282874）及检测分析后发现,样品中只含有单组份双生病毒,并且与日本报道的番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leafcurl virus,TYLCV）分离物相似性最高,为99.8%,因此认为SH1和SH2是TYLCV的分离物,TYLCV是一类全世界广泛发生并引起严重危害的双生病毒,但这是我国首次报道有该病毒。从广东省表现为黄脉、叶脉外突和矮化等症状的稀莶样品（GD11、GD12、GD13、GD16、GD21、GD22、GD24、GD25、GD27和GD30）上分离到了双生病毒。利用简并引物PA/PB扩增得到约500 bp的片段,其相似性为95.4-100%。随机选择GD13、GD24和GD27进行全序列测定（登录号AM183224、AM230634-5）,序列比较表明,它们相互之间的相似性为99.7-99.8%,与中国番木瓜曲叶病毒（Papaya leaf curl China virus,PaLCuCNV）的相似性最高,为76.8%。根据双生病毒命名原则,将其命名为稀莶黄脉病毒（Siegesbeckia yellowvein virus,SbYVV）。利用Southern blot和PCR检测,发现所有样品中都含有卫星分子DNAβ。对GD13、GD24和GD27 DNAβ全序列测定（登录号AM230643-5）及分析后发现,他们相互间的相似性为98.3-98.7%,并与其它已报道的DNAβ的相似性都很低,其中与泽兰黄脉病毒（Eupatorium yellow vein virus,EpYVV）卫星分子DNAβ最高,相似性分别为44.0、43.9和45.6%。随后,在这些样品中又分离到了两类DNA1分子。这两类DNA1分子的全长核苷酸序列相似性为66.2%,分别与赛葵黄脉病毒（Malvastrum yellow vein virus,MYVV）和烟草曲茎病毒（Tobaco curly shoot virus,TbCSV）DNA1的相似性最高,分别为为72.6%利69.1%。对所有样品的进一步分析发现,GD13、GD21、GD22、GD24和GD27中存在这两类DNA1分子的复合侵染。从广东地区表现曲叶症状的赛葵样品（GD6-10）上分离到了双生病毒。利用简并引物PA/PB扩增得到约500 bp的片段,其相似性为92.8-97.1%。随机选择GD6和GD9进行全基因组序列测定,全长均为2767 nts（登录号AM236779-80）,两者间的相似性为98.9%,与已报道的PaLCuCNV相似性最高,为85.2%,因此将其命名为广东赛葵曲叶病毒（Malvastrum leaf curl Guangdongvirus,MLCGdV）。重组分析发现,GD6可能是一个重组分子,由PaLCuCNV、菲律宾番茄曲叶病毒（Tomato leaf curl Philippines Virus,ToLCPV）和其它未知病毒重组形成的。利用PCR和southern blot检测方法,均未在样品中发现DNA-B、DNAB或DNA1分子的存在。为进一步验证MLCGdV的致病性,构建了MLCGdV分离物GD6的侵染性克隆,发现农杆菌单独接种MLCGdV即可在本氏烟、心叶烟和矮牵牛等寄主植物上诱导产生典型的双生病毒侵染症状。而利用粉虱传毒试验,MLCGdV能在赛葵和普通烟上引起曲叶症状。此外,与中国番茄黄化曲叶病毒（Tomato yellow leaf curl China virus,TYLCCNV）卫星分子DNAβ的互作研究发现,MLCGdV能支持TYLCCNV DNAβ的复制。从广东地区表现为曲叶、叶片边缘上卷、脉突和耳突等症状扶桑样品（GD33-38）中分离到了双生病毒。利用简并引物PA/PB对6个分离物扩增的约500 bp片段的相似性为97.3-99.0%。随机选择GD35和GD37分离物扩增病毒全长基因组DNA和DNAβ,序列分析表明,两者基因组的相似性为99.7%,DNAβ的相似性为99.8%,并分别和广东地区扶桑上已发现的木尔坦棉花曲叶病毒（Cotton leaf curl Multan virus,CLCuMV）和DNAB的相似性最高,为99.3%和99.5%及97.8%和98.0%。因此,认为GD33-38是CLCuMV的分离物。CLCuMV是一类在巴基斯坦广泛发生并引起严重危害的双生病毒,在中国属于检疫性病毒。构建了CLCuMV DNA-A和DNAβ的侵染性克隆并对其致病性进行测定。CLCuMV单独接种寄主植物不能诱导产生病毒侵染症状,但在接种的本氏烟、心叶烟、番茄和矮牵牛样品中能检测到病毒DNA的存在,说明CLCuMV能在这些寄主中自我复制。CLCuMV和DNAβ混合接种,能在番茄、木氏烟、普通烟、三生烟、矮牵牛和棉花等实验寄主中诱导典型的病害症状。从广西地区表现为植株矮化和黄脉等症状的稀莶样品（G110-112）分离到了双生病毒。利用简并引物PA/PB对3个分离物扩增的约500 bp片段的相似性为95.0-97.3%。随机选择G111分离物扩增病毒全长基因组DNA,序列测定表明全长为2784 nts（登录号AM238692）,与SbYVV相似性最高,为84.5%,是一类新型的双生病毒,命名为广西稀莶黄脉病毒（Siegesbeckia yellow vein Guangxivirus,SbYVGxV）。从G111中发现有DNAβ,全长1355 nts（登录号AM238695）,G111DNAp可能是由SbYVV DNAβ和其它未知基因重组而来。构建了已鉴定的一品红曲叶病毒（Euphorbia leaf curl virus,ELCV）G35分离物的侵染性克隆并进行致病性测定。发现ELCV单独接种寄主植物能诱导典型症状,并能与TYLCCNV DNAβ互作,扩大寄主范围,诱导产生更严重的症状。同时,ELCV与TYLCCNV DNAβ能侵染通常双生病毒较难侵染的寄主植物,如大豆、棉花、辣椒和黄瓜等,但不产生症状。