橡胶草HMGR基因的克隆及表达分析

论文摘要

橡胶草（Taraxacum kok-saghyz Rodin）又称为俄罗斯蒲公英,是一种天然产胶植物,它的根中含有20%以上的橡胶,而普通蒲公英则没有或很少。橡胶草提取的橡胶与巴西橡胶的结构和性能相似,且产胶周期短,是从非巴西橡胶传统种植区（热带地区）获取天然橡胶的一个快速途径。关于橡胶草的研究,最早见于19世纪50年代,主要集中在栽培、生理和生化方面。分子生物学方面的研究较少。目前,橡胶资源的急剧不足,橡胶草作为产胶植物,再次成为美国和欧盟国家新一轮能源植物研究的热点,重点研究筛选橡胶草高产品系、探索稳产高产栽培技术以及胶乳提取工艺和橡胶合成分子生物学等。鉴于前期在橡胶树胶乳HMGR基因克隆方面的工作基础,选择橡胶合成途径中的关键酶HMGR作为研究对象,开展实验工作。本研究利用简并RT-PCR和RACE技术,从橡胶草植株中成功克隆了HMGR基因,对其进行了序列分析、生物信息学分析、组织定量表达分析,主要结果如下：1、获得的橡胶草HMGR基因全长为1928 bp,包括107 bp的5’-UTR、73 bp的3’-UTR和1749 bp的ORF；在ORF内包含起始密码子ATG和终止密码子TGA,整个ORF编码582个氨基酸；在起始密码子ATG附近存在Kozak序列；推导的HMGR蛋白分子量为62.61889 kD,等电点为5.68。2、生物信息学分析表明：橡胶草HMGR基因具有4个催化结构域：2个HMG-CoA结合motif:EMPVGYVQIP和TTEGCLVA;2个NADPH结合motif:DAMGMNM和GTVGGGT。不存在信号肽,不是分泌蛋白；含明显的疏水区；具有2个跨膜结构,位于A43和A65、A85和A107之间,属于跨膜蛋白；预测其主要定位于细胞膜,具有电压门通道、信号传导和转录功能。3、利用荧光定量PCR技术分析了HMGR基因在橡胶草不同组织中的表达,发现HMGR基因在根、种子、叶中的表达量高,花梗较少,花中最少。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 1 前言
• 1.1 橡胶草的生物学研究现状
• 1.1.1 橡胶草的形态研究
• 1.1.2 橡胶草的栽培研究
• 1.1.3 橡胶草的染色体研究
• 1.1.4 橡胶草乳管系统的研究
• 1.1.5 橡胶草的生理及产胶机制研究
• 1.1.6 橡胶草的分子生物学研究现状
• 1.2 高等植物3-羟基-3-甲基戊二酰辅酶A还原酶（HMGR）的研究进展
• 1.2.1 HMG-CoA还原酶的重要作用
• 1.2.2 HMG-CoA还原酶的结构特征
• 1.2.3 HMG-CoA还原酶的克隆研究
• 1.2.4 植物HMGR基因的差别表达及其与植物类异戊二烯代谢途径的关系
• 1.2.5 HMG-CoA还原酶的调控
• 1.3 基因表达的定量分析方法
• 1.3.1 RNA印迹
• 1.3.2 核糖核酸酶保护分析
• 1.3.3 实时荧光定量PCR
• 1.3.4 cDNA微阵列技术
• 1.3.5 蛋白质印迹
• 1.4 定量分析中内参基因的选用
• 1.5 本项研究的目的和意义
• 1.6 本项研究的技术路线
• 2 材料和方法
• 2.1 材料与试剂
• 2.1.1 植物材料
• 2.1.2 质粒与菌种
• 2.1.3 生化试剂
• 2.2 方法与步骤
• 2.2.1 RNA的提取
• 2.2.2 总RNA中微量DNA的去除
• 2.2.3 cDNA第一链的合成
• 2.2.4 HMGR保守区域的扩增
• 2.2.5 3' -cDNA末端扩增
• 2.2.6 5' -cDNA末端扩增
• 2.2.7 HMGR全长的克隆
• 2.3 橡胶草HMGR基因生物信息学分析
• 2.3.1 HMGR基因全长cDNA序列分析
• 2.3.2 HMGR蛋白质生物信息学分析
• 2.4 橡胶草HMGR基因组织表达分析
• 2.4.1 根、叶、花梗、花、种子的RNA提取及浓度测定
• 2.4.2 18S基因及HMGR基因标准曲线制作
• 3 结果与分析
• 3.1 RNA的提取
• 3.2 HMGR基因的克隆
• 3.2.1 HMGR基因的保守区扩增及分析
• 3.2.2 HMGR基因3' RACE扩增
• 3.2.3 HMGR基因5' RACE扩增
• 3.2.4 HMGR基因全长的克隆
• 3.3 HMGR基因的生物信息学分析
• 3.3.1 HMGR基因全长序列分析
• 3.3.2 HMGR蛋白质生物信息学分析
• 3.4 橡胶草HMGR基因的组织表达分析
• 3.4.1 橡胶草组织RNA提取及含量测定
• 3.4.2 18S及HMGR基因标准曲线的制作
• 3.4.3 HMGR基因组织表达实时定量PCR分析
• 4 讨论
• 4.1 关于橡胶草的研究
• 4.2 关于HMGR的功能
• 4.3 橡胶草今后的研究展望
• 5 结论
• 参考文献
• 附录
• 致谢