DON无毒phage-ELISA检测方法的建立及展青霉素免疫学检测初探

论文摘要

脱氧雪腐镰刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）和展青霉素（Patulin，PAT）都属于真菌毒素。脱氧雪腐镰刀菌烯醇是由镰刀菌的某些种产生的化学结构和生物活性相似的有毒代谢产物—单端孢霉烯族化合物中的一种，主要污染小麦、玉米等谷物及其制品，温带地区的谷物污染严重，在收割季节如雨量偏多则DON的污染更为严重。脱氧雪腐镰刀菌烯醇不仅具有致动物呕吐等急性毒素性、生殖毒性、免疫毒性，而且与人的癌症相关。展青霉素是由某些真菌（扩张青霉、展青霉、棒型青霉等）产生的一种次级代谢产物，主要污染苹果和山楂及其制品，具有肾脏和消化系统毒性、致癌性、致畸、致突变作用和免疫毒性。因此，及时对食品及其原料中的真菌毒素进行检测，防止真菌毒素（如DON、PAT）污染的食品进入食物链，是预防真菌毒素对人和动物带来危害的主要手段。虽然薄层层析法（TLC）、高效液相法（HPLC）、气相色谱法（GC）已应用于脱氧雪腐镰刀菌烯醇和展青霉素的定量检测，但这些检测方法比较昂贵和耗时，因为检测过程中需要使用大量的有机溶剂、贵重的设备和繁杂的样品净化。免疫学检测方法具有高选择性、灵敏、快速、一次可检测多个样品、对样品的纯度要求不高、操作简单等特点，特别适合于大批量样本的检测。为建立DON的免疫学检测方法，本研究在制备DON人工抗原的基础上，研制抗DON单克隆抗体；利用抗DON单克隆抗体建立DON酶联免疫检测方法（ELISA）；制备DON单克隆抗体免疫亲和层析柱，应用于HPLC等检测中样品的净化处理；从噬菌体随机七肽库中淘选DON的模拟表位，并以之替代DON人工抗原建立间接竞争ELISA方法。本研究还进行了抗展青霉素多（单）克隆抗体的初步研究，并合成了一种展青霉素的结构类似物。结果如下。 1．采用N，N’-羰基二咪唑（CDI）法将脱氧雪腐镰刀菌烯醇分子与载体蛋白MBSA偶联制备人工抗原，免疫BALB／c小鼠，应用杂交瘤技术，筛选到一株能稳定分泌抗DON单克隆抗体的杂交瘤细胞株（命名为12D1），小鼠单抗腹水的效价达1∶5.12×105，抗体亚类为IgG2a。单克隆抗体12D1与15-AC-DON、3-AC-DON、雪腐镰刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮和桔霉素的交叉反应率分别为400％、1.6％、4.3％、＜1％和＜0.3％。应用单克隆抗体12D1建立的DON间接竞争ELISA

论文目录

• 目录
• 本研究的创新之处
• 中文摘要
• ABSTRACT
• 缩略语（Abbreviations）
• 第一部分 DON无毒phage-ELISA检测方法的建立
• 1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇文献综述
• 1.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的发现
• 1.2 脱氧雪腐镰刀菌烯醇的理化性质
• 1.3 谷物及其制品DON的污染情况
• 1.4 DON的毒性和作用机理
• 1.4.1 DON的急性毒性
• 1.4.2 DON的吸收及代谢
• 1.4.3 DON的免疫毒性
• 1.4.4 DON的细胞毒性效应
• 1.4.5 DON的生殖毒性
• 1.5 DON的提取、纯化与检测
• 1.5.1 DON的提取技术
• 1.5.2 DON的净化技术
• 1.5.3 DON的检测技术
• 1.6 DON的防控
• 1.7 选题目的和意义
• 2 材料与方法
• 2.1 试剂与仪器
• 2.2 实验方法和步骤
• 2.2.1 MBSA（Modified Bovine Serum Albumen）的制备
• 2.2.2 DON免疫抗原（DON-MBSA）的制备
• 2.2.3 DON检测抗原（DON-HG-OVA）的制备
• 2.2.4 抗DON多克隆抗体的制备
• 2.2.5 抗DON单克隆抗体的制备
• 2.2.6 抗DON单克隆抗体特性的鉴定
• 2.2.7 脱氧雪腐镰刀菌烯醇酶联免疫吸附检测方法的建立
• 2.2.8 DON单克隆抗体免疫亲和层析柱的研制
• 2.2.9 DON噬菌体七肽模似表位的淘选及应用
• 2.2.10 DON无毒间接竞争ELISA检测方法的建立
• 3 结果
• 3.1 DON人工抗原的制备及免疫效果
• 3.1.1 DON—HG的制备（封闭、接臂、解封闭）
• 3.1.2 DON—HG与载体蛋白的偶联（3-HG-DON-OVA的制备）
• 3.1.3 DON免疫抗原（DON-MBSA）的制备及免疫BALB／c小鼠
• 3.2 抗DON单克隆抗体的制备
• 3.2.1 细胞融合
• 3.2.2 杂交瘤细胞的筛选
• 3.2.3 抗DON单克隆抗体的生产和纯化
• 3.3 抗DON单克隆抗体的鉴定
• 3.3.1 杂交瘤细胞的染色体分析
• 3.3.2 抗DON单克隆抗体的类别和亚类鉴定
• 3.3.3 杂交瘤细胞12D1分泌抗体的稳定性
• 3.3.4 单克隆抗体亲和力常数的测定
• 3.3.5 抗DON单克隆抗体特异性测定结果
• 3.4 DON间接竞争ELISA检测方法的建立
• 3.4.1 DON间接竞争ELISA标准曲线
• 3.4.2 甲醇浓度对ELISA的影响
• 3.4.3 不同提取液对DON回收的影响
• 3.4.4 小麦、玉米样品DON加标回收检测结果
• 3.4.5 间接竞争ELISA法与进口ELISA试剂盒检测样品DON结果
• 3.4.6 自建的ELISA检测饲料样品中DON结果
• 3.5 DON免疫亲和层析柱的研制
• 3.5.1 脱氧雪腐镰刀菌烯醇醇HPLC检测方法的建立
• 3.5.2 免疫亲和柱使用条件
• 3.5.3 DON免疫亲和柱洗脱液的选择
• 3.5.4 DON免疫亲和柱性能评价
• 3.5.5 免疫亲和柱-HPLC法检测小麦、玉米和饲料中DON含量
• 3.6 DON噬菌体七肽模似表位的淘选及应用
• 3.6.1 大肠杆菌E. coli ER2738生长曲线的测定
• 3.6.2 亲和淘选结果
• 3.6.3 噬菌体阳性克隆的鉴定
• 3.6.4 阳性噬菌体竞争抑制曲线
• 3.6.5 DON无毒ELISA检测方法（phage-ELISA）的建立及应用
• 4 讨论
• 4.1 DON人工抗原的制备
• 4.1.1 载体蛋白的选择
• 4.1.2 小分子偶联基团的选择
• 4.1.3 偶联方法的选择
• 4.1.4 DON羟基保护
• 4.1.5 DON检测抗原的制各
• 4.2 抗DON单克隆抗体的制备
• 4.3 DON的免疫检测
• 4.4 DON七肽模似表位的淘选
• 5 小结
• 第二部分 展青霉素免疫以检测初探
• 6 展青霉素文献综述
• 6.1 展青霉素理化性质
• 6.2 展青霉素的主要产生菌
• 6.3 食品中展青霉素的污染情况
• 6.4 展青霉素的毒性
• 6.4.1 急性和亚急性毒性
• 6.4.2 致癌性
• 6.4.3 致畸、致突变作用
• 6.4.4 对免疫系统的影响
• 6.5 展青霉素的检测
• 6.5.1 薄层色谱法（TLC）
• 5.5.2 气相色谱法（GC）
• 6.5.3 高效液相色谱法（HPLC）
• 6.5.4 免疫学检测方法
• 6.6 展青霉毒素的防控
• 7 材料与方法
• 7.1 主要实验材料
• 7.2 实验方法和步骤
• 7.2.1 展青霉素人工抗原（PAT-HG-OVA）的制备
• 7.2.2 展青霉素人工抗原PAT-MBSA的制备
• 7.2.3 抗展青霉素多克隆抗体的制各
• 7.2.4 抗展青霉素单克隆抗体的研究
• 7.2.5 展青霉素结构类似物的合成
• 8 结果
• 8.1 展青霉素活化结果
• 8.2 PAT-HG与载体蛋白的偶联
• 8.3 抗展青霉素多克隆抗体的制备
• 8.4 抗展青霉素单克隆抗体的研究
• 8.5 展青霉素结构类似物的合成结果
• 8.5.1 化合物B（4-羟基-4H-5,6-二氢-苯并呋喃）的合成
• 8.5.2 化合物C（2-羧亚甲基-3-羟基-环己酮）的合成
• 8.5.3 化合物D（2-甲酯亚甲基3-3-羟基-环己酮）的合成
• 8.5.4 展青霉素结构类似物（4-羟基-4H-5,6-二氢-苯并呋喃（3,2C）-2-酮）的合成
• 8.6 展青霉素结构类似物稳定性结果
• 9 讨论
• 9.1 展青霉素人工抗原及多克隆抗体的制备
• 9.2 展青霉素结构类似物的合成
• 10 小结
• 11 参考文献
• 12 致谢
• 个人简厉
• 13 博士研究生期间撰写的学术论文