克氏原螯虾C型凝集素的表达与功能研究

论文摘要

克氏原螯虾（Procambarus clarkii）又叫淡水小龙虾,是我国重要的水产经济动物,同时也是是一种比较好的研究甲壳纲动物先天免疫的实验动物。在克氏原螯虾中,发现了很多免疫相关的基因,包括模式识别受体及免疫效应分子等。C-型凝集素是一类钙依赖型糖结合蛋白超家族。它们在先天免疫中作为模式识别受体发挥作用,并具有其他多种功能。为了更深入的了解C-型凝集素在克氏原螯虾中的功能多样性,我们对其凝集素进行了表达与功能研究。通过对克氏原螯虾血细胞cDNA文库进行随机测序并利用BLAST进行比对,得到了一个C-型凝集素的cDNA,我们把它命名为PcLec5。该cDNA序列全长为771bp,其中开放阅读框为516bp,编码一个含有171个氨基酸的蛋白。除此之外,5’和3’的非编码区分别为20和235bp。PcLec5含有一个17个氨基酸的信号肽,说明其是一个分泌型蛋白。Smart分析表明其含有一个CTLD结构域,其结构域共含135个氨基酸。通过半定量RT-PCR分析,PcLec5的mRNA在肝胰腺中特异存在,且含量较高。为了研究PcLec5的可能的功能,我们分别用鳗弧菌和金黄色葡萄球菌刺激螯虾,利用实时定量PCR检测了PcLec5在刺激后的表达模式。我们发现,在受到鳗弧菌刺激后,PcLec5的表达水平迅速提高,在刺激后12小时达到顶峰,之后逐步下降；在受到金黄色葡萄球菌刺激后,表达缓慢上升,在48小时升至最高,之后恢复至正常水平,这种变化表明PcLec5可能参与了先天免疫反应。我们通过PCR扩增得到PcLec5的成熟肽cDNA序列,将其与pET30a （+）载体连接,转化DH5α细胞,筛选到的阳性克隆培养后提取质粒,再转化表达菌株BL21 （DE3）,诱导表达重组蛋白进行纯化,得到了PcLec5的重组蛋白。经细菌结合实验表明,rPcLec5可以与实验所用的多种细菌（包括革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌）结合,提示可能起到模式识别受体的功能。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号说明
• 第一章 综述
• 一、无脊椎动物的先天免疫
• 1. 概述
• 2. 模式识别受体
• 二、C型凝集素研究进展
• 1. C型凝集素的结构
• 2. C型凝集素的功能研究
• 2.1. 昆虫C型凝集素
• 2.2. 甲壳动物C型凝集素
• 第二章 克氏原螯虾C型凝集素（PcLec5）的功能研究
• 一、前言
• 二、实验材料和方法
• 1. 材料
• 1.1 实验材料
• 1.2 组织分离
• 1.3 主要实验用试剂
• 1.4 主要实验用设备
• 2. 实验方法
• 2.1 提取总RNA
• 2.2 第一链cDNA的合成
• 2.3 基因克隆
• 2.4 序列分析和系统进化分析
• 2.5 半定量PCR
• 2.6 实时定量PCR
• 2.7 重组蛋白的表达与纯化
• 2.8 细菌结合实验
• 三、实验结果
• 1. 基因克隆和序列分析
• 2. 进化树分析和序列比对
• 3. PcLec5在mRNA水平上的表达模式
• 4. PcLec5成熟肽的重组表达和纯化
• 5. PcLec5结合细菌的活性
• 四、讨论
• 总结
• 参考文献
• 致谢
• 在读期间发表文章
• 学位论文评阅及答辩情况表