暗纹东方鲀B细胞刺激因子（fBAFF）及γ-IFN诱导的溶酶体巯基还原酶（fGILT）的克隆、表达及生物学功能的研究

论文摘要

本实验以暗纹东方纯B淋巴细胞刺激因子（fBAFF）和γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（fGILT）基因克隆、蛋白表达及蛋白生物活性检测为研究方法,旨在弄清楚它们的免疫作用及在进化上的地位。暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子的克隆、表达和活性研究。B淋巴细胞刺激因子是对B细胞分化和存活起着重要作用的一种细胞因子。本研究中,暗纹东方纯的BAFF基因被鉴定。暗纹东方纯的BAFF开放阅读框为789个核苷酸序列并翻译成262个氨基酸。BAFF基因组结构有六个外显子和五个内含子组成,其基因组大小1.8kb。序列比对结果表明氨基酸序列拥有TNF特征：跨膜区、潜在的弗林酶切位点、三个半胱氨酸残基。预测的BAFF三维结构显示与人的三维结构很相似。实时定量PCR（Real-timePCR）分析显示fBAFF主要表达在暗纹东方鲀的脾脏中。SUMO-fsBAFF和GFP/fsBAFF在大肠杆菌Rosseta （DE3）中表达,并用镍柱纯化和SDS-PAGE、western blot分析。激光共聚焦直观的观察GFP/fsBAFF与小鼠B细胞的结合。体外MTT检测和流式细胞检测表明SUMO-fsBAFF能够促进暗纹东方纯脾细胞存活；SUMO-fsBAFF和anti-IgM共刺激促进小鼠脾脏B淋巴细胞的增值。这些结果表明BAFF在鱼类中是能够强化免疫应答的免疫因子。干扰素-γ诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）在MHCⅡ抗原呈递过程中的二硫键还原起着重要作用。在这项研究中,暗纹东方鲍GILT （fGILT）基因被鉴定。fGILT编码一个242个氨基酸的蛋白,分子量为26.7kDa,并且拥有GILT蛋白的特征性序列：CQHGX2ECX2NX4C. CXXC基序和C端5个半胱氨酸残基。基因组分析显示fGILT包括1836个核苷酸残基,其中外显子7个,内含子6个,并和人、小鼠的外显子-内含子结构相似。系统树分析显示fGILT位于脊椎动物分支,说明可能与其他脊椎动物GILT蛋白来源于同一个祖先。荧光实时定量PCR结果显示fGILT mRNA以组织特异性的形式表达,并且经过脂多糖（LPS）刺激后在脾脏和肾脏中显著上调。研究显示fGILT与细菌感染时的免疫应答有关。这也为人类疾病的动物模型提供了研究基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分 文献综述
• 第1章 B淋巴细胞刺激因子（BAFF）的研究进展
• 1.1 BAFF的分子结构
• 1.2 BAFF受体的表达分布及结构
• 1.3 BAFF诱导的信号转导
• 1.4 生物学功能
• 1.5 BAFF与疾病
• 1.6 自身免疫病的治疗
• 1.7 结论和展望
• 第2章 γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）
• 2.1 GILT的活性特征
• 2.2 GILT的表达分布
• 2.3 GILT与李斯特病相关
• 2.4 国内外研究概况、水平和发展趋势
• 第3章 暗纹东方鲍简介
• 3.1 河鲀鱼的分类及形态特征
• 3.2 河鲀鱼的习性及分布
• 3.3 河鲀鱼的养殖及病害防治
• 3.4 国内外对河鲀鱼的研究现状
• 参考文献
• 第二部分 实验部分
• 第4章 暗纹东方鲀B淋巴细胞刺激因子（BAFF）的克隆、表达及活性鉴定
• 4.1 实验材料
• 4.2 实验方法
• 4.3 实验结果与分析
• 4.4 讨论
• 第5章 暗纹东方鲀γ-干扰素诱导的溶酶体巯基还原酶（GILT）的克隆和表达分析
• 5.1 实验材料
• 5.2 实验方法
• 5.3 实验结果及分析
• 5.4 讨论
• 总结
• 参考文献
• 附录:在读期间发表的学术论文及研究成果
• 致谢