论文摘要
金荞麦（Fagopyrum dibotrys）属双子叶蓼科荞麦属的多年生草本植物。它是我国民间传统的一种中草药,具清热解毒,排脓消肿,祛风化湿的功效。研究表明金荞麦根茎叶中含有丰富的黄酮物质,是其重要的药用成分。黄酮类物质是通过苯丙烷类代谢途径及其支路所产生的。苯丙氨酸解氨酶（Phenylalanine ammonia-lyase, PAL EC4.3.1.5）是催化该途径第一步反应的酶,也是连接植物初级代谢与次生代谢的关键酶和限速酶。本文以金荞麦为实验材料,克隆其苯丙氨酸解氨酶基因（FdPal）,并实现其在大肠杆菌中的表达,为深入研究该酶结构与功能,逐步厘清其次生代谢途径奠定基础。本研究主要取得以下结果。1.采用PCR技术,分别扩增金荞麦苯丙氨酸解氨酶（FdPAL）的cDNA和DNA序列。序列分析表明,该酶基因DNA序列全长2622bp,包括两个外显子（外显子1：1bp-419bp;外显子2:834bp-2622bp）,及一个"GU-AG"型内含子（420bp-833bp）。该基因cDNA编码序列全长2169bp,含一个开放阅读框（ORF）,编码722个氨基酸,预测相对分子质量为78.31kDa,等电点为5.94,属稳定性蛋白。采用Clustal X1.81软件对FdPAL和其他13种植物PAL进行氨基酸多序列比对分析。结果表明,PAL家族氨基酸序列有两个保守区域；但在该酶N末端,变异很大,各来源PAL的前29个氨基酸残基同源性非常低。采用Neighbor-joining法构建其系统进化树。结果表明,金荞麦与同属植物苦荞麦和甜荞麦的PAL相似性分别达到94%和99%,与其他物种的相似率在80%-82%2.构建金荞麦苯丙氨酸解氨酶基因的pET30b-FdPal原核表达载体,并实现其在大肠杆菌BL21 （DE3）中的高效表达。SDS-PAGE分析表明,诱导表达后,新生蛋白分子量75.37 kDa。酶活分析表明,苯丙氨酸解氨酶比活力在诱导表达后4 h达到最高,为4386 nmol/g·min。薄层层析分析表明,诱导表达产物具有催化苯丙氨酸转化为肉桂酸的活性。