喉癌候选抑癌基因LCRG1启动子的克隆及功能初步研究

论文摘要

喉癌是头颈部常见肿瘤之一,也是严重危害人类健康的一种临床常见的恶性肿瘤。然而到目前为止,人们对喉癌发生发展的分子机制仍缺乏完整而清晰的了解,文献方面对喉癌的研究报导也甚少。有研究表明LCRG1 （Laryngeal Carcinoma Related Gene 1）基因在喉癌组织中表达缺失和下调,这提示喉癌相关基因LCRG1的表达缺失和下调与喉上皮癌变有关。但该基因启动子的转录调控机制并不清楚,因此我们采用分子生物学和生物信息学手段对LCRG1基因的转录调控机制进行初步研究,这将有助于了解与肿瘤相关的基因表达谱改变的分子机制。方法（1）应用5′RACE法确定LCRG1基因的转录起始位点;（2）运用生物信息学方法分析和预测LCRG1基因的启动子区域及核心启动子区域DNA片段内潜在的转录因子结合位点;（3）以荧光素酶报告基因载体为基础,利用PCR及酶切亚克隆法对LCRG1基因的上游顺序开展一系列的5′、3′缺失突变;（4）通过瞬时转染/体外双荧光素酶报告系统对这些重组质粒中的插入片段进行启动子活性分析;（5）通过一些常见的真核表达质粒与pGL3-LCRG1核心启动子重组质粒的共转染实验,鉴定对LCRG1核心启动子活性有影响的反式作用因子。结果（1） 5′RACE结果发现大部分约450 bp和600 bp 5′RACE接头之后的碱基是A ,从而确定LCRG1基因的转录起始点为A,将该转录起始位点A设为+ 1,该转录起始点位于翻译位点前284 bp处,提前LCRG1 - mRNA （AF268387） 5′端47 bp ;（2）利用启动子在线预测软件对LCRG1基因的启动子区域进行预测,共获得五种可能的启动子区域;通过实验得到核心启动子区域后,为确定核心启动子区域可能存在的转录调控元件,我们进一步应用在线MatInspector软件分析系统发现,在该区域存在多个转录因子如Sp1,Zf9,Egr-1等结合位点;（3）瞬时转染结果发现含LCRG1基因转录起始位点上游-169位到+127位DNA片段的缺失突变质粒的启动活性较其它组高,表明此区域为LCRG1基因的核心启动子区域;（4）共转染结果显示外源性的转录因子Sp1能够提高LCRG1基因启动子的活性。结论（1） LCRG1基因的转录起始点为A,该转录起始位点A位于翻译位点前284bp处,提前LCRG1 - mRNA （AF268387） 5′端47 bp ;（2）LCRG1基因核心启动子区域位于转录起始点上游-169到+127（296bp）的DNA片段;（3）外源性的转录因子Sp1能够上调LCRG1基因核心启动子的活性。

论文目录

• 中文摘要
• ABSTRACT
• 前言
• 第一部分：LCRG1 基因转录起始位点的确定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第二部分：生物信息学分析及LCRG1 基因启动子的分离与鉴定
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 第三部分：外源性转录因子SP1 对LCRG1 基因核心启动子活性的影响
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 附录（主要英文缩略语索引）
• 硕士期间发表的论文
• 致谢