论文摘要
胃癌是我国常见恶性肿瘤，其发病率和死亡率仍处于较高水平，农村地区和部分城市胃癌发病率似有上升趋势。由于症状和良性胃部疾病鉴别困难，早期的胃癌不易被发现，诊断时多数已是中晚期，失去手术机会，化疗成为最重要的非手术治疗方法。近年虽有进展，但胃癌化疗的有效率偏低，多数患者不能从中获益。因此预知胃癌的化疗反应，个体化选择有效策略，有助于改善群体患者生存，胃癌标志物的研究可为临床决策提供有益帮助。肿瘤标志物的研究近年来取得了较快发展，多种标志物在胃癌组织中的表达与胃癌化疗疗效相关。E-cadherin是一种关键的上皮细胞粘附分子，其异常表达与胃癌的浸润和转移密切相关，可能参与了耐药现象的发生，其表达异常可能与肿瘤细胞化疗敏感性有关联。本研究用免疫组化的方法检测了42例胃癌组织中E-cadherin表达，观察了患者采用FOLFOX4方案化疗后的客观疗效，分析了E-cadherin阳性表达与化疗疗效、临床病理学特征及生存的相关性。E-cadherin降解后可产生一种可溶性的蛋白质，分子量为80kD，后被发现是可溶性的E-cadherin（sE-cad）。这种蛋白可被肿瘤细胞释放入培养液中，抑制E-cadherin功能，影响细胞的生长转移特性及化疗药物敏感性在肿瘤患者的血清和尿液中能够检测到sE-cad的高水平表达，这提示sE-cad和肿瘤的发生存在紧密关联。本研究采用ELISA方法检测了化疗前与化疗第8周胃癌患者血清sE-cad表达水平，分析了其与FOLFOX4方案化疗疗效及生存的关系。RNAi是近年发展起来的一种抑制基因表达的新型技术，其利用RNA介导，特异性地阻断和降低目的基因的表达，不仅操作简单，而且效果好且稳定，已广泛用于分子生物学研究，成为研究基因在肿瘤中的作用的良好工具。本研究通过慢病毒介导的siRNA抑制E-cadherin在胃癌SGC-7901细胞中的表达，观察了E-cadherin表达抑制前后的SGC-7901细胞对5-FU化疗敏感性的影响，检测了细胞的凋亡及可能的分子机制。本研究包括以下主要内容：第一部分胃癌组织E-cadherin和胃癌患者血清中sE-cad的表达方法1.免疫组化检测42例胃癌组织标本中E-cadherin蛋白表达。2. ELISA检测42例胃癌患者血清中sE-cad的表达。3.比较分析E-cadherin阳性表达与临床病理特征的关系。4.比较分析血清sE-cad与临床病理特征的关系。5.比较分析胃癌组织E-cadherin蛋白表达与血清sE-cad表达的相关性。6.统计学分析：数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。计量资料采用t检验，计数资料采用χ2检验，检验水准以P＜0.05为有显著统计学差异。结果1. E-cadherin主要在胃癌细胞膜呈现阳性表达，阳性表达率为42.86%。2. E-cadherin的阳性表达与年龄、病理分级显著相关，与性别、临床分期、原发肿瘤部位无相关。3.胃癌患者化疗前血清sE-cad的水平显著高于健康对照组。4.血清sE‐cad表达水平与年龄、病理分级、性别、临床分期、原发肿瘤部位均无显著相关。5.胃癌组织E-cadherin蛋白表达与血清sE-cad表达无显著相关。第二部分胃癌组织中E-cadherin表达与化疗疗效的关系方法1.免疫组化检测42例胃癌组织标本中E-cadherin蛋白表达情况。2.42例患者采用FOLFOX4方案化疗3个周期，观察化疗疗效，进行生存随访。3.比较分析E-cadherin阳性表达率与化疗疗效的相关性。4.比较分析E-cadherin阳性表达与PFS和OS的关系。5.统计学方法：所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验。Kaplan-Meier法进行生存分析，Long-rank行有效性检验。检验水准以P＜0.05为有显著统计学差异。结果1. E-cadherin阳性表达与化疗疗效显著相关，化疗有效者存在较高E-cadherin表达率。2. E-cadherin表达阳性的患者较阴性表达者显示较好的中位PFS，但无显著性差异。3. E-cadherin表达阳性的患者较阴性表达者显示较好的中位OS，但无显著性差异。第三部分胃癌患者血清中sE-cad表达与化疗疗效的关系方法1. ELISA测定胃癌患者化疗前与化疗第8周血清sE-cad表达水平。2.42例患者采用FOLFOX4方案化疗3个周期，观察化疗疗效，进行生存随访。3.比较分析化疗前后血清sE-cad表达变化与临床病理特征的关系。4.比较分析化疗前后血清sE-cad表达变化与PFS和OS的关系。5.统计学方法：所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。计数资料采用χ2检验，计量资料采用t检验，包括配对样本t检验和独立样本t检验。Kaplan-Meier法进行生存分析，Long-rank行有效性检验。检验水准以P＜0.05为有显著统计学差异。结果1.化疗前与化疗后第8周相比，血清sE-cad表达水平未见显著变化。2.化疗前后sE-cad表达变化在Ⅱ/Ⅲ期患者中存在显著差异。3.有效组化疗后血清sE-cad表达水平较化疗前显著下降，进展组表现为化疗后血清sE-cad表达水平较化疗前升高。4.有效组和无效组化疗后sEC水平下降或上升的患者比例存在显著差异。5.有效组和无效组化疗前血清sE-cad表达水平存在显著统计学差异。6. PFS≥4.6个月患者化疗后血清中的sE‐cad表达水平较化疗前显著下降，PFS＜4.6个月患者无显著变化。7. OS≥9.6个月患者化疗后血清中的sE‐cad表达水平较化疗前显著下降，OS＜9.6个月患者无显著变化。第四部分慢病毒介导的E-cadherin基因沉默对胃癌SGC-7901细胞增殖和凋亡的影响方法1.将慢病毒siRNA-CDH1感染胃癌SGC-7901细胞，RT-PCR和western blot检测E-cadherin在mRNA和蛋白的表达。2. E-cadherin表达抑制前后，MTT法检测5-FU作用的胃癌SGC-7901细胞生长抑制率的变化。3.流式细胞术检测E-cadherin表达抑制前后，SGC-7901细胞对5-FU诱导凋亡的影响。4. RT-PCR检测E-cadherin表达抑制前后，SGC-7901中Bcl-2和bax mRNA的表达。5. ELISA检测E-cadherin表达抑制前后SGC-7901细胞培养液中sE-cad的表达。6.统计学方法：所有数据采用SPSS17.0软件包进行统计学分析。计量资料采用t检验。检验水准以P＜0.05为有显著统计学差异。结果1.慢病毒介导的E-cadherin干扰能有效抑制胃癌SGC-7901细胞中E-cadherin的基因和蛋白表达水平。2. E-cadherin表达被抑制后，SGC-7901细胞对5-FU化疗的敏感性显著下降，有效抑药浓度增加。3. E-cadherin表达被抑制后，SGC-7901细胞对5-FU化疗诱导的细胞凋亡率的显著下降。4. E-cadherin表达被抑制后，Bcl‐2mRNA表达增高，Bax mRNA表达下降，但差异无显著性。5.当用5‐FU诱导SGC‐7901细胞凋亡时，Bcl‐2mRNA表达则显著增高，Bax mRNA表达显著下降。6. E-cadherin表达被抑制后，SGC-7901细胞培养液上清中可溶性E-cadherin的表达下降。结论1.胃癌组织中E-cadherin蛋白阳性表达与年龄、病理分级有关，与性别、临床分期、原发肿瘤部位无关。2.胃癌患者血清sE-cad表达显著高于健康对照，与临床病理特征无关。3.胃癌组织中E-cadherin表达与血清sE-cad表达无显著相关。4.胃癌组织中E-cadherin蛋白阳性表达与胃癌FOLFOX4方案化疗疗效有关，和患者生存无显著相关。E-cadherin蛋白阳性表达患者有较好疗效。5.胃癌患者血清sE-cad表达与FOLFOX4方案化疗疗效有关，客观有效者化疗后sE-cad表达显著下降，无效者显著升高。化疗前sE-cad高表达预示有较好疗效。6.下调E-cadherin表达显著降低5-FU对胃癌SGC-7901细胞的生长抑制率。7.下调E-cadherin表达显著降低5-FU对胃癌SGC-7901细胞诱导的凋亡，伴随Bcl‐2mRNA表达增高，Bax mRNA表达下降。9.下调E-cadherin表达减少SGC-7901细胞培养液中sE-cad的表达。