琼脂糖Protein A反向免疫共沉淀技术纯化高活性BTV方法的建立

论文摘要

快速、有效、经济地从生物材料如动物、植物、微生物和离体培养物中高通量获取高活性、高纯度的目的生物大分子是生物制品生产的中心环节。传统的技术手段很多,国内外病毒纯化和制备多采用经典的离心技术、PEG或过硫酸铵沉淀技术,透析法、层析技术等等。这些传统方法在大批量生产和推广应用上均存在各种弊端。本研究以蓝舌病毒（Bluetongue virus,BTV）为模型,结合有限的离心和琼脂糖蛋白质A沉淀目标生物大分子的背景杂质,达到获取高纯度,高活性生物大分子的目的。该方法与传统的技术不同,沉淀的不是目标物质,而是背景杂质,故命名为琼脂糖蛋白质A反向免疫共沉淀技术（Protein A intermediary reverse co-immunoprecipitation,PARIP）。 反复冻融破碎裂解的未感染病毒的Vero细胞800rpm离心10分钟后,取上清,制备成抗原,以常规方法免疫家兔,制备抗Vero细胞碎片和抗小牛血清的多克隆抗体。在一定的温度、pH值、反应时间和振荡速度等条件下,利用蛋白质A能与IgG抗体非特异性牢固结合的特点,将免疫家兔所得多克隆抗体耦联到琼脂糖Protein A上;再利用抗体抗原特异性结合的特点,以此耦联了抗体的琼脂糖Protein A去吸附细胞培养病毒增殖混合悬液（经12000rpm,15min离心去沉淀）中的Vero细胞碎片及小牛血清抗原。发生上述反应的试管以1000rpm,15min低速离心,可使介质琼脂糖Protein A及其上附着的抗原抗体复合物沉淀下来,上清即为纯化的含单一病毒成分的悬液。琼脂糖双向免疫扩散检测纯化后的病毒悬液,悬液中不含抗Vero细胞碎片及小牛血清抗原的抗体。介质琼脂糖ProteinA上吸附的抗原抗体复合物可用缓冲液B洗去后继续使用。用透射电镜观察病毒纯化效果,纯化后的病毒悬液背景清晰,病毒粒子多且轮廓清楚。高效液相色谱检测纯化前后病毒样品的各成分含量,得到纯化前病毒样品中有多个较高的峰,而纯化后病毒样品中只含有单一的峰。病毒峰面积占所有峰面积的98.9%,小牛血清杂质的含量控制在5ng/mL以下,效果显著,符合中国生物制品质量检测的要求。在Vero细胞上检测病毒悬液的TCID50,纯化前混合有杂质的病毒悬液TCID50为4x10-5.25/ml,纯化后病毒悬液TCID50为4×10-4.7/ml,在100,10-1,10-2,10-3这四个稀释度下,所计算纯化得率分别79.81%,77.90%,78.13%,55.42%。此结果表明纯化前后病毒粒子的生物学活性损失不大。以上实验研究结果表明:该实验方法操作简便,效果显著,切实

论文目录

• 一、中文摘要
• 二、英文摘要
• 三、引言
• 四、正文
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 结论
• 参考文献
• 五、综述
• 正文
• 参考文献
• 六、后记