葛根素及葛根粗提物对顺铂抑制肺癌H446细胞生长的影响

论文摘要

肺癌是人类最常见的恶性肿瘤之一,在我国许多城市已位居全部恶性肿瘤死因的首位。我国多数地区的肺癌发病率和死亡率在过去的20～30年间迅速增长,并将继续保持这一增长趋势,成为严重危害我国人民身体健康的最主要疾病之一。化疗是目前治疗中晚期肿瘤的主要手段,缺点是对瘤体细胞产生杀伤作用的同时,对正常组织细胞也同样产生杀伤作用,特别是对生长迅速的血细胞,骨髓细胞等损害更大。顺铂（cisplatin,DDP）是一种作用较强的抗肿瘤药物,对各种实体瘤均具有显著的临床疗效,但是其严重的副作用对患者的生活质量有很大的影响。寻找一些毒性小、副反应少且有一定疗效的天然药物治疗肿瘤,或者利用它们增加化疗药物的敏感性就显得极其重要。这些物质目前主要有两个来源:一是植物性食物中的植物次级代谢产物,另一种是中草药中的抗癌物质成分。葛根异黄酮是药食两用植物野葛干燥根的提取物的成分,近年来研究发现其具有抗癌作用,但其抗癌活性低于葛根粗提物。本实验采用的葛根粗提物是采用醇提取法提取的药食两用植物葛根中的主要生物活性物质成分群,与葛根素纯品相比,其提取方法相对简单,且保留了较多的生物活性成分,这些物质能否对顺铂的化疗起到增敏作用,即是本研究的目的所在。本实验采用人小细胞肺癌H446细胞作为靶细胞,采用噻唑兰（MTT）比色法、流式细胞术、免疫细胞化学法检测bcl-2和bax蛋白的表达来探讨葛根素、葛根粗提物与顺铂单独或联合应用对小细胞肺癌H446细胞的影响。观察经无作用浓度（80μg/ml）的葛根素、葛根粗提物和不同浓度的顺铂单独或联合处理后细胞增殖与凋亡的变化,为葛根素、葛根粗提物对顺铂的化疗增敏作用提供实验依据。目的本课题旨在研究葛根素纯品（standard of pure puerarin,SP）、葛根粗提物（pueraria crude extract,CP）单独或协同不同浓度顺铂（DDP）对人小细胞肺癌H446细胞体外生长的影响,通过测定细胞凋亡相关基因表达的情况,进一步探讨肿瘤细胞凋亡的相关机制,为减轻肺癌化疗的毒副作用,制定合理的联合化疗方案,寻求最佳治疗效果提供理论依据。方法本实验单独或联合应用80μg/ml的葛根素纯品（SP）、葛根粗提物（CP）和不同浓度的顺铂作用于H446细胞系,采用噻唑兰（MTT）比色法检测药物对细胞生长的抑制作用;流式细胞术检测细胞凋亡率和细胞周期分布情况;免疫组化法检测凋亡相关蛋白bcl-2和bax的表达状况。结果1.葛根素、葛根粗提物作用于H446细胞24h后能抑制H446细胞的生长,这种抑制作用与浓度相关（P＜0.05）。40μg/ml,80μg/ml,160μg/ml,320μg/ml,640μg/ml的SP、CP分别作用于体外生长的H446细胞系24h后细胞生长的抑制率SP为:0.09%,2.03%,10.90%,17.03%,22.64%;CP为1.70%,3.49%,12.17%,19.29%,27.03%。2.SP、CP与不同浓度顺铂联合作用于H446细胞,作用效果均大于单独应用顺铂;葛根粗提物与顺铂的联合作用效果强于葛根素。24hSP与DDP联用的抑制率分别为15.5%,18.6%,24.9%,37.2%;CP与DDP联用的抑制率分别为15.6%,21.2%,25.4%,37.7%;DDP单独使用的抑制率分别为13.9%,15.6%,24%,27.8%。联合组高于单独用顺铂组。3.SP与不同浓度顺铂联合作用于H446细胞24h后,细胞的凋亡率为:6.1%,17.5%,24.4%,26.6%;PI为:37.6%,29.5%,26.3%,21.9%;CP与不同浓度顺铂联合作用于H446细胞24h后,细胞凋亡率:8.1%,14.9%,24.4%,33.7%,21.9%,PI为:34.1%,28.2%,25%,21.1%。DDP单独使用时细胞的凋亡率为4.9%,6.1%,12.2%,17.7%,PI为:38.1%,31.1%,27.8%,23.6%。4.通过对凋亡相关基因bcl-2和bax的表达情况的检测,bcl-2的表达呈下降趋势,bax的表达呈上升趋势,bcl-2/bax呈下降趋势。结论1.80μg/ml以下SP、CP单独作用不影响H446细胞的生长。2.SP、CP能增强顺铂抑制H446细胞的生长作用。3.SP、CP能增强顺铂将细胞阻滞于G0/G1期,诱导细胞分化。4.SP、CP可以增强顺铂抑制bcl-2的表达而增强bax表达,且呈浓度相关性。这可能是抑制肿瘤细胞增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的分子机制之一。5.CP与顺铂联合应用后对细胞生长的抑制作用、诱导细胞分化的作用均强于SP与顺铂联合。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 方法
• 2 结果
• 2.1 H446细胞生长曲线
• 2.2 流式细胞仪检测细胞周期和凋亡率
• 2.3 80μ/ml SP、CP与不同浓度顺铂联合对H446细胞生长的抑制作用
• 2.4 流式细胞仪检测结果
• 2.6 SP、CP联合DDP对H446细胞bcl-2和bax蛋白表达的影响
• 3 讨论
• 3.1 CP、SP与顺铂联合对H446细胞的增殖抑制作用
• 3.2 CP、SP与顺铂联合对H446细胞的细胞周期影响
• 3.3 CP、SP与顺铂联合对凋亡相关蛋白bcl-2和bax的影响
• 3.4 CP、SP效应的比较
• 4 结论
• 参考文献
• 综述 黄酮类化合物的研究进展
• 参考文献
• 附表1 主要黄酮类化合物的结构
• 附图2 流式细胞仪检测结果
• 附图 免疫组化结果图
• 英文缩略词
• 后记
• 一、发表文章
• 二、致谢