论文摘要
特发性血小板减少性紫癜（idiopathic thrombocytopenic purpura,ITP）,也称自身免疫性血小板减少性紫癜（autoimmune thrombocytopenic purpura,AITP）,是临床最为常见的出血性疾病,约占出血性疾病总数的30%。本病的实质是一种自身免疫性疾病,其发病机制复杂,主要是由于人体自身免疫耐受机制被打破,体液免疫和细胞免疫紊乱,产生抗自身血小板抗体或激活细胞毒T细胞,导致血小板破坏增加和/或生成障碍。目前,国内外对于ITP的一、二线治疗以肾上腺皮质激素、静脉丙种球蛋白及脾切除为主,但仍有25%～30%的患者上述治疗无效或短期内复发,成为难治性ITP,迁延不愈,甚至危及生命,对这部分患者目前有名目繁多的非常规治疗比如免疫抑制剂、骨髓移植等,但是常常缺乏有效性和安全性。因此亟需探索更为有效和安全的治疗方法。自身免疫性疾病的发生主要与自身免疫耐受的破坏有关,因此去除导致耐受破坏的因素或再次诱导对自身抗原的耐受,有助于控制自身免疫性疾病的发生和发展。近年来研究人员从自身免疫性疾病发病机理的不同角度出发,开始探寻一些新型的免疫治疗方法,有些方法已逐步应用于临床试验。口服耐受（oral tolerance）是通过肠道粘膜接触抗原而诱导的一种免疫应答低下状态,是诱导机体产生免疫耐受的重要方法之一。口服耐受的确切机制迄今尚不清楚,目前认为其形成机制主要依赖于口服抗原的剂量:低剂量口服抗原可刺激调节性T细胞(包括CD4+CD25highTr细胞、CD8+CD28-Ts细胞、NKT细胞、γδT细胞等)的分化,引起主动性免疫抑制（active suppression）,其机制可能是通过分泌抑制性细胞因子（女HTGF-β、IL-4、IL-10等）,诱导以Th2和Th3应答为主的效应,即发生“免疫偏离”。而这种主动性抑制还能作用于非特异性免疫应答,即旁路抑制（bystander suppression）;高剂量口服抗原可导致T细胞克隆缺失（clonal deletion）和/或克隆无能（clonal anergy）,诱导耐受的产生。另外,何种机制占优势还与口服抗原的时间、形式及次数有关。口服耐受具有应用方便,无明显毒性,且不必明确特异性自身抗原的独特优点,因此为治疗自身免疫性疾病提供了新的途径和思路。口服耐受应用于T细胞介导的自身免疫性疾病动物模型的防治已有不少成功的报道,如自身免疫性脑脊髓炎、胶原或佐剂诱发的关节炎、1型糖尿病（NOD小鼠）、自身免疫性葡萄膜炎、自身免疫性重症肌无力等,且多发性硬化、类风湿性关节炎、1型糖尿病、自身免疫性葡萄膜炎等已有临床试验报道。基于ITP的自身免疫性发病机制,应用口服抗原诱导免疫耐受的研究具有可行性。已有前期研究应用口服自身血小板治疗ITP,虽然存在获取足够自身血小板的困难和血小板保存方法的局限,但是这种方法具备极大的潜在优势,如自身抗原的易接近性（血小板膜糖蛋白）、评价指标的客观性（血小板计数）等,而且除了自身血小板,已有专家指出还可以应用同种异体血小板、培养的自身血小板以及分离纯化的血小板糖蛋白如GPⅡb/Ⅲa。ITP动物模型的建立有利于阐明ITP的发病机制,分析药物的治疗作用,并进一步探讨新的治疗方法。一个理想的ITP动物模型应该能模拟人类ITP的所有特点,如易感性、发病机制和临床过程,同时具备可操作性和稳定性。数十年来,已有众多的造模方法应用于ITP的研究,如抗血小板血清及多/单克隆抗体造模方法、（NZW×BXSB）F1小鼠自发模型等。我们参照国外有关文献加以改进,用主动免疫法建立理想的ITP动物模型,并通过喂食血小板抗原,研究口服耐受对ITP的防治作用,并探讨其可能机制。第一部分免疫性血小板减少（ITP）小鼠模型的建立目的:建立ITP小鼠模型,初步探讨其体液及细胞免疫机制方法:应用Wistar大鼠血小板（模型组）或PBS（对照组）腹腔免疫CBA/CaJ小鼠,每周取血检测血常规,监测血小板计数及平均血小板体积（MPV）水平的变化,并应用流式细胞术检测血小板相关抗体（PAIgG）,应用Western blot技术检测血小板洗脱抗体特异性,应用CCK-8检测特异性抗血小板淋巴细胞增殖反应,应用ELISA试剂盒检测血浆IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10水平,同时观察骨髓细胞形态学,尤其是巨核细胞系的数量和发育情况。结果:与对照组相比,模型组血小板计数于初次免疫后第3周达第一个低谷,第6周达第二个低谷（P＜0.05）,第8、9周降至最低（P＜0.01）,第10周骤然回升至正常甚至更高,MPV相应地逐渐增大再逐渐恢复,而骨髓巨核细胞形态和数量均无显著变化;免疫机制研究显示PAIgG显著增高（P＜0.05）,Westernblot显示血小板洗脱抗体可与与GPIbα（CD42b）分子量相当的蛋白结合,特异性抗血小板淋巴细胞增殖反应增强（P＜0.05）;与免疫前相比,模型组血浆IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平均有所增高（P＜0.05）,分别于免疫后第6周、第3和7周、第4周、第4周达峰值,第10周均降至正常水平。结论:基于抗原模拟原理成功建立了理想的、稳定的、最大程度模拟人体的ITP小鼠模型,不仅发病过程与人类ITP相似,而且发病机制亦与人类ITP相符,为ITP的实验研究提供了有力的工具。第二部分小鼠GPIbα（CD42b）GST融合蛋白的原核表达及其诱导ITP小鼠模型口服耐受的初步研究目的:构建小鼠GPIba（CD42b）原核表达载体,制备GPIba-GST融合蛋白,并探讨经口服途径GPIbα-GST融合蛋白对ITP小鼠模型的防治作用及可能机制。方法:将小鼠GPIbα的开放读码框分成四个片段,片段之间有10-15个氨基酸的重叠,经RT-PCR扩增目的基因,重组到原核表达质粒pGEX-6P-1中,用限制性内切酶酶切和DNA测序法进行鉴定,IPTG诱导重组质粒pGexGPIba转化的大肠杆菌BL21（DE3）,通过SDS-PAGE、Western blot分析表达产物,大量表达后经谷胱甘肽Sepharose 4B亲和层析获得纯化产物。按不同剂量（高、中、低）将ITP小鼠模型分组,每组4-6只,以灌胃针喂食实验小鼠纯化GPIbα/GST融合蛋白（耐受组）或PBS（溶剂对照组）,并设空白对照组（免疫PBS,口服PBS）,观察血小板参数,检测PAIgG以及血浆IFN-γ、IL-2、IL-4、IL-10、TGF-β水平,同时应用流式细胞技术检测外周血、脾脏及肠系膜淋巴结中CD4+CD25high调节性T细胞占CD4+T细胞的比例(%CD4+CD25high/CD4+)。结果:限制性内切酶酶切和DNA测序分析证实成功获得小鼠GPIbα四个基因片段,并准确克隆入pGEX-6P-1,pGexGPIbα经诱导表达出分子量与理论值相符的GST融合蛋白,其中GST/GPIbα1-214和GST/GPIbα306-537为可溶性表达,GST/GPIbα198-315和GST/GPIbα527-734为包涵体表达,用变性复性方法获得目的蛋白,另外免疫印迹法证实GST/GPIbα306-537能与抗小鼠GPIbot（CD42b）单克隆抗体特异性结合,纯化后的目的蛋白纯度均达90%以上。口服耐受实验中,与溶剂对照组相比,高剂量耐受组血小板减少的幅度缓和,血小板降至最低的时间延迟至第10周,血小板减少的持续时间缩短至1～2周（P＜0.05）,MPV变化不显著,PAIgG水平降低;调节性T细胞检测结果显示与空白对照组相比,溶剂对照组各组织的%CD4+CD25high/CD4+明显减低（P＜0.05）,而高剂量耐受组虽然亦有所减低,但未达显著水平;与溶剂对照组相比,高剂量耐受组各组织的%CD4+CD25high/CD4+平均水平均有所增加,但无显著差异;血浆细胞因子检测结果显示与空白对照组相比,溶剂对照组IL-2、IFN-γ、IL-4、IL-10水平增高（P＜0.01）,TGF-β水平降低（P＜0.01）,而高剂量耐受组IL-4、IL-10水平增高（P＜0.01）,IFN-γ水平有所增高,IL-2、TGF-β水平有所降低,但均未达显著水平;与溶剂对照组相比,高剂量耐受组IL-2、IFN-γ、IL-10水平降低（P＜0.05）,TGF-β水平增高（P＜0.05）,IL-4水平亦有所增高,但无显著差异。结论:成功构建pGexGPIbα原核表达载体,并高效表达、大量纯化GPIbα/GST融合蛋白,该融合蛋白经口服途径可改善ITP小鼠模型的病程和病情,可能是通过活化CD4+CD25high及其他调节性T细胞分泌抑制性细胞因子纠正Th1偏离,从而诱导以Th2和Th3应答为主的效应。
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标签：特发性血小板减少性紫癜论文; 口服耐受论文; 动物模型论文; 辅助性细胞论文; 调节性细胞论文;