论文摘要
急肝衰竭全球发病率较高,病情凶险,预后较差,内科药物治疗病死率高；由于供肝缺乏及免疫排斥问题临床上仅约10%的患者实施了肝移植；肝细胞移植治疗和生物型人工肝辅助系统的应用也由于种子细胞来源缺乏和细胞移植后增殖效率低下而受到限制。因此急性肝衰竭的治疗一直是临床上亟待解决的难题。干细胞生存微环境（stem cell niche）是干细胞生活的特定环境,维持并调节干细胞的生物学特性,使之在静息态、自我更新和分化上保持平衡。深入研究肝脏干细胞niche的结构与功能将充分激发内源性肝脏干细胞在肝脏再生中的修复潜能。这种方法不需要外源性的供体,也不存在免疫排斥的问题,是肝损伤疾病治疗的理想方法。肝星状细胞（hepatic stellate cells, HSCs）作为肝脏干细胞niche中重要的支持细胞在肝脏再生中的作用及机制尚未阐明。本研究首先明确了活化的HSCs在急性肝损伤再生修复中的作用；接着建立了小鼠肝星状细胞分离纯化和体外培养模型,并观察不同活化阶段HSCs的生物学特性；最后探明活化的HSCs旁分泌途径是否参与急性肝损伤再生修复的过程并阐述相关作用机制。第一部分小鼠肝星状细胞活化不良对急性肝损伤再生修复的影响目的明确活化的小鼠肝星状细胞（mouse hepatic stellate cells, m-HSCs）在急性肝损伤时是否具有促进肝细胞有丝分裂和/或肝脏干细胞增殖的作用。方法在对乙酰氨基酚（acetaminophen, APAP）诱导的化学性急性肝损伤小鼠模型基础上,通过连续腹腔注射胶毒霉素（gliotoxin, 1mg/kg体重）消除肝内活化的星状细胞,建立肝星状细胞活化不良（loss of function）模型。通过细胞毒性实验,观察gliotoxin对肝细胞和Kupffer细胞的影响。并利用该模型,从小鼠血清转氨酶浓度、生存分析、肝细胞坏死及凋亡程度、CD45阳性淋巴细胞浸润程度、肝细胞和卵圆细胞增殖能力等方面评估活化的HSCs在肝急性损伤再生修复中的作用。结果胶毒霉素的肝细胞毒性实验显示,胶毒霉素（3mg/kg体重）单次腹腔注射后,与对照组相比,在血清转氨酶ALT、AST的浓度、肝损伤组织学评分、肝细胞增殖能力方面均无明显差异（P>0.05）。m-HSCs活化不良模型中发现,Gliotoxin组活化的HSCs （a-SMA+-HSCs）数目为（13.13±2.92）/FOV,较对照组（130.12±20.44）/FOV下降90%,存在显著统计学差异（P<0.01）。碳颗粒吞噬实验显示,两组小鼠肝内碳颗粒阳性Kupffer细胞的数目无明显差异（P>0.05）。Gliotoxin组与对照组相比,血清转氨酶ALT、AST的浓度分别升高73%（P<0.05）和72%（P<0.01）,具有统计学差异。生存分析提示,Gliotoxin组小鼠5天生存率明显下降为55%,对照组为89%,两组间具有统计学差异（P<0.05）。Gliotoxin组与对照组相比,肝损伤组织学评分分别为（2.41±0.52）和（3.43±0.74）,两组间具有统计学差异（P<0.01）；CD45阳性淋巴细胞数目分别为（146.49±52.87）/FOV和（99.06±26.35）/FOV,两组间具有统计学差异（P<0.01）；凋亡的肝细胞数目分别为（16.94±9.33）/FOV和（4.29±3.06）/FOV,两组间具有统计学差异（P<0.01）；BrdU阳性肝细胞的数目减少66%,分别为（3.83±1.92）/FOV和（11.29±5.21）/FOV,两组间具有统计学差异（P<0.01）,同时5个肝细胞增殖相关基因的表达程度出现不同程度下降,为（0.2～4.3）倍；其中OSM, EGF,IL6基因的表达水平明显下降,两组间具有明显统计学差异（P<0.01）,HGF、SCF基因的表达水平也出现下降,两组间具有统计学意义（P<0.05）；肝内PanK阳性卵圆细胞（Oval cell, OVc）的数目分别为（7.64±4.03）/FOV和（8.54±4.14）/FOV,两组间具有统计学差异（P<0.05）,同时Gliotoxin组CK19基因的表达程度明显下降（P<0.05）。结论肝星状细胞活化不良加重APAP诱导的急性肝损伤；肝星状细胞活化不良同时导致肝细胞有丝分裂能力下降和卵圆细胞增殖能力下降。第二部分小鼠肝星状细胞分离纯化和体外培养模型的建立目的建立小鼠肝星状细胞分离纯化的高效稳定方案,并通过原代和传代培养观察其生物学特性的变化。方法采用二氯亚甲基二膦酸脂质体（CL2MDP-liposome）腹腔注射（10ml/kg体重）预处理小鼠,三天后依次应用预灌注液、0.1% Pronase E、0.075% CollagenaseNB4G对在体肝脏原位灌注消化。肝脏离体后,在0.02%DNase I液中磁力搅拌消化10min,低速离心（25g,5min）去除残余肝实质细胞,进一步用Optiprep密度梯度液获得纯化的m-HSCs。采用碳颗粒吞噬实验检测Kupffer细胞的吞噬功能；台盼蓝染色法评估细胞得率及活率；采用自发荧光及油红O染色鉴定细胞纯度；采用光镜、电镜以及Desmin/a-SMA免疫荧光双染色观察不同培养阶段HSCs的细胞形态和生物学特征。结果C57BL/6小鼠24只,体重（22.47±1.13）g,肝重（1.30±0.14）g,肝重和体重比为1:17.28。CL2MDP-liposome预处理后的小鼠分离得到的原代m-HSCs数量为（1.62±0.34）×106/g肝脏,细胞纯度为（94.44±1.89）%,细胞活率为（94.41±1.50）%; PBS-liposome组m-HSCs的细胞得率为（1.37±0.23）×106/g肝脏,细胞纯度为（90.18士1.61）%,细胞活率为（94.51±1.61）%。CL2MDP-liposome组m-HSCs在细胞得率和细胞纯度方面均优于PBS-liposome组（P＜0.05/P<0.01）：两组间细胞活率无明显差异（P>0.05）,两组细胞经第一次传代培养后细胞纯度均接近100%。静止期和不同活化阶段的m-HSCs在亚显微结构以及a-SMA表达强度方面存在差异。结论二氯亚甲基二膦酸脂质体能选择性清除肝内Kupffer细胞,并提高m-HSCs分离的细胞得率和细胞纯度；通过改良在体肝脏灌注消化过程,优化密度梯度离心技术,成功建立了高效稳定的m-HSCs分离纯化及体外培养模型；早期活化阶段和完全活化阶段的m-HSCs在细胞表型和亚细胞结构方面存在差异性。第三部分小鼠肝星状细胞旁分泌因子在急性肝损伤再生修复中的作用目的明确活化的HSCs旁分泌因子在急性肝损伤再生修复中的作用及机制。方法采用原代培养第5天和传代培养第三代的HSCs分别制备成早期活化阶段和完全活化阶段的HSCs旁分泌因子,应用蛋白芯片进行蛋白成分差异性分析；分别将早期活化阶段和完全活化阶段的HSCs旁分泌因子通过小鼠尾静脉进行体内移植,观察两者对APAP （750mg/kg体重）诱导的急性肝衰竭的治疗作用,并从促进细胞增殖、抗细胞坏死及凋亡、调节炎症反应水平三方面评估HSCs旁分泌因子的作用及机制；采用早期活化的HSCs旁分泌因子作为条件培养基在体外与肝细胞进行培养,从抗APAP诱导的肝细胞损伤、促细胞增殖及代谢功能方面评估其作用；进一步分离培养小鼠成体肝脏干细胞（adult hepatic progenitor cell, AHPC）,将早期活化的HSCs旁分泌因子作为条件培养基进行培养,观察其对AHPC增殖及代谢能力的影响。结果体内实验：与HSC-CM （P3）组、对照组小鼠相比,HSC-CM（5d）组小鼠血清ALT浓度分别下降42%和46%；AST浓度分别下降42%和45%；均存在统计学差异（P<0.01）；HSC-CM （P3）组与对照组相比,无明显统计学差异。急性肝损伤组织学评分,提示HSC-CM （5d）组、HSC-CM （P3）组和对照组的评分分别为（2.25±0.45）、（3.51±0.57）和（3.75±0.51）；HSC-CM （5d）组的评分低于HSC-CM （P3）组和对照组,均存在统计学差异（P<0.01/P<0.05）。HSC-CM （P3）组和对照组相比,无统计学差异。生存分析提示,HSC-CM（5d）组小鼠5天生存率为85%；HSC-CM （P3）组为51%；对照组（Vehicle）为42%,HSC-CM （5d）组生存率明显优于对照组,两组间存在统计学差异（P<0.05）；HSC-CM （5d）组与HSC-CM （P3）组相比以及HSC-CM （P3）组与对照组相比均无统计学差异。进一步以HSC-CM （5d）为对象进行重点研究,经过尾静脉移植后,HSC-CM（5d）组和对照组肝内CD45阳性的淋巴细胞数分别为（45.58±28.72）/FOV和（125.20±54.05）/FOV,两组之间存在显著差异（P<0.01）。全身炎症反应水平方面,与对照组相比,HSC-CM（5d）组小鼠血清IL6浓度无明显下降；而前炎症细胞因子IFNγ、IL1ra、IL1β的浓度均出现不同程度的下降,两组间存在统计学差异（P<0.05）；TNFa下降68%,两组间存在显著统计学差异（P<0.01）；抗炎细胞因子IL10的浓度明显升高（P<0.05）,是对照组的1.9倍。肝细胞凋亡方面,HSC-CM （5d）组肝内TUNEL阳性的肝细胞核数为（3.93±1.77）/FOV,与对照组的（23.52±4.02）/FOV相比,减少83%,两组之间存在显著统计学差异（P<0.01）。肝细胞有丝分裂方面,对照组肝内BrdU阳性的肝细胞核数为（5.05±3.14）/FOV；与之相比,HSC-CM（5d）组增多2倍,为（15.60±7.19）/FOV,两组之间存在显著统计学差异（P<0.01）；进一步从基因水平验证,提示与对照组相比,HSC-CM （5d）组肝内5个肝细胞增殖相关基因（OSM, IL6、HGF, EGF, SCF）的表达水平均发生不同程度的上调,升高幅度约为（2-32）倍。肝脏干细胞增殖方面,对照组肝内PanK阳性的OVc数为（7.26±2.56）/FOV；与之相比,HSC-CM （5d）组为（8.97±3.75）/FOV,两组之间存在统计学差异（P<0.05）。进一步行RT-PCR提示,HSC-CM （5d）组肝组织内CK19和EpCAM基因的表达水平均发生上调,两组间存在统计学差异（P<0.01/P<0.05）。蛋白芯片：进行蛋白成分差异性分析提示,早期活化和完全活化的HSCs旁分泌因子共同表达所检测的144种细胞因子中的69种。两者整体构成相似,均主要由细胞趋化因子、细胞素、细胞生长因子、结合蛋白、细胞外间质修复相关因子等构成。对69种细胞因子进行组间比较,发现浓度相差2倍以上的细胞因子共7种,分别为单核细胞趋化蛋白-1、巨噬细胞炎性趋化蛋白-1γ、肝细胞生长因子、白细胞介素10、间质金属蛋白酶-2、干细胞因子和Fas蛋白配体。体外实验：APAP诱导的体外肝细胞损伤提示,在APAP浓度为1.25mmol/L时,HSC-CM（5%）组细胞活性优于HSC-CM（10%）组,分别为（86.17±4.84）%和（78.01±5.10）%,两组间存在统计学差异（P<0.05）；当APAP浓度达到5mmol/L时,三组细胞的活性相比,HSC-CM（5%）组细胞活性为（45.67±2.23）%,分别优于对照组的（42.33±2.58）%和HSC-CM （10%）组的（39.34±3.33）%,均具有统计学差异（P<0.05）。在其他的APAP浓度时,三组间细胞活性相比均无统计学差异。将HSC-CM （5d）作为条件培养基与肝细胞培养后,BrdU掺合实验提示对照组中BrdU阳性肝细胞数目为（34.40±13.23）/FOV,而HSC-CM （5d）组增多47.97%,为（50.90±17.10）/FOV,两组相比存在统计学差异（P<0.05）。进一步检测细胞的代谢功能提示,对照组和HSC-CM（5d）组细胞上清液中Albumin的浓度分别为（4.35±1.33）μg/ml/d和（6.56±2.32）μg/ml/d,两组间存在统计学差异（P<0.05）。对照组和HSC-CM （5d）组细胞上清液中Urea的浓度分别为（13.44±6.12）μg/ml/d和（23.74±8.84）μg/ml/d,两组间存在统计学差异（P<0.05）。将HSC-CM （5d）作为条件培养基与AHPC培养后,HSC-CM （5d）组和对照组细胞的克隆形成率分别为（29.18±3.71）%和（21.08±2.94）%,两组间存在统计学差异（P<0.05）。BrdU掺合实验提示对照组BrdU和Albumin双阳性的细胞数目为（73.50±17.81）/FOV,而HSC-CM （5d）组增多66.12%,为（122.10±26.28）/FOV,两组相比存在显著统计学差异（P<0.01）。进一步检测细胞的代谢功能提示,HSC-CM （5d）组细胞上清液中Albumin的浓度为（14.47±3.04）μg/ml/d,比对照组的（8.93±2.52）μg/ml/d提高62.04%,两组间存在统计学差异（P<0.01）。HSC-CM（5d）组细胞上清液中Urea的浓度为（34.83±12.21）μg/ml/d,比对照组的（20.87.44±9.53）μg/ml/d提高66.89%,两组间存在统计学差异（P<0.05）。结论活化的HSCs通过旁分泌途径参与急性肝损伤再生修复过程；早期活化阶段和完全活化阶段的HSCs旁分泌因子在急性肝损伤再生修复中的作用存在差异；早期活化阶段的HSCs旁分泌因子具有保护肝损伤和促进肝修复的作用,机制包括：抗肝细胞坏死／凋亡,促肝细胞／肝脏干细胞增殖,下调炎症反应水平。全文结论1.活化的HSCs具有减轻急性肝损伤；促进肝细胞／肝脏干细胞增殖的作用。2.活化的HSCs通过旁分泌途径发挥急性肝损伤的保护作用并促进肝脏再生修复。3.活化的HSCs旁分泌途径的作用机制：抗肝细胞坏死／凋亡；促肝细胞／肝脏干细胞增殖；下调炎症反应水平。