Ⅰ型鸭肝炎病毒RNA聚合酶（RdRp）的基因克隆、表达及其亚细胞定位分析

论文摘要

【目的】克隆1型鸭肝炎病毒（DHV-1）RNA依赖性RNA聚合酶（RdRp）的编码基因；利用原核表达载体pET32a（+）表达RdRp，以表达产物为抗原，制备抗RdRp的多克隆抗体；利用真核表达载体pEGFP-C3，在细胞内表达RdRp，分析其在真核细胞中的亚定位情况。【方法】（1）根据DHV-1ZJ-Ⅴ株基因组序列（GenBank No.EF382778），设计了一对扩增RdRp的特异性引物，以ZJ-Ⅴ株DHV基因组cDNA为模板，扩增RdRp基因，运用DNAStar软件对ZJ-Ⅴ株病毒与GenBank上已发表的其他不同DHV毒株的RdRp基因序列进行同源性比较和遗传进化分析；将RdRp基因克隆入原核表达载体pET-32a（+），获得重组表达质粒pET-RdRp，转化宿主菌E.coli BL21（DE3），用IPTG进行诱导表达，最后，利用SDS-PAGE及Western blot进行鉴定。（2）构建RdRp与增强型绿色荧光蛋白（EGFP）融合表达的真核重组表达质粒，然后用脂质体介导转染MDCK细胞。分别使用荧光显微镜、激光共聚焦显微镜，DAPI染色和蛋白免疫电泳试验等方法检测RdRp在细胞中的表达和亚细胞定位情况。【结果】（1）成功扩增到DHV-1RdRp的编码基因，该基因长1359个核苷酸，编码453个氨基酸。利用分子生物学软件对DHV-1不同毒株的RdRp基因进行了生物信息学分析，结果显示，本论文克隆到的RdRp基因与A型DHV-1R85952株（DQ226541）的同源性为97.1%，亲缘关系最近；与2株台湾新型（B型）DHV之间为76.9%和77.0%，与C-GY株和4株韩国新型（C型）DHV株之间为76.2%-76.5%，亲缘关系较远。（2）利用原核表达载体成功表达了RdRp蛋白，SDS-PAGE分析结果显示RdRp蛋白分子量约为65ku， Western blot分析证明表达产物能与1型鸭病毒性肝炎阳性血清产生特异性免疫反应，具有良好的免疫学活性。以表达的RdRp免疫实验兔，成功制备了特异性良好的抗RdRp的多克隆抗体。（3）构建了真核重组表达质粒pEGFP-RdRp，该重组质粒转染真核细胞后，使用Western blot方法进行检测，证明成功表达了与EGFP融合的RdRp蛋白。然后，通过DAPI染色，使用激光共聚焦显微镜对细胞中融合蛋白的表达和分布进行观察，发现RdRp主要分布于细胞核中，细胞质中分布较少，提示RdRp可能在细胞质中进行翻译，然后转移到细胞核以发挥其复制酶功能。【结论】本文成功克隆并表达了RdRp基因，制备了特异性良好的多克隆抗体；实现了RdRp基因在真核细胞中的表达，并对其在真核细胞中的表达进行了定位分析。本论文为进一步研究DHV-1RdRp的结构、功能及DHV-1的复制机理等奠定了物质基础。

论文目录

• 摘要
• Summary
• 缩略词英汉对照表
• 第一章 绪论
• 1 鸭肝炎病毒研究进展
• 1.1 病毒的病原特性
• 1.2 病毒的基因组结构及其功能
• 1.2.1 非编码区
• 1.2.2 编码区
• 1.3 病原检测
• 1.4 展望
• 2 正链 RNA 病毒复制酶结构与功能研究进展
• 2.1 RdRp 概述
• 2.2 RdRp 的氨基酸序列与高级结构
• 2.2.1 RdRp 的氨基酸序列特征
• 2.2.2 RdRp 的高级结构特征
• 2.3 RdRp 的生物学功能与作用机制
• 2.4 RdRp 的研究意义
• 2.4.1 有助于研发抗病毒药物
• 2.4.2 有助于研发疫苗
• 2.4.3 有助于研究 RNA 病毒的分子演化
• 2.5 结语
• 3 研究目的和意义
• 4 研究内容和方法
• 第二章 Ⅰ型鸭肝炎病毒 RNA 聚合酶基因（RdRp）的克隆及原核表达
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 主要试剂
• 1.1.2 病毒株
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物设计与合成
• 1.2.2 RdRp 基因的克隆及其诱导表达
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的构建
• 2.2 表达产物及其免疫原性的检测
• 2.3 RdRp 基因核苷酸序列比较及其推导的氨基酸序列分析
• 2.4 遗传进化分析
• 3 讨论
• 第三章 鸭肝炎病毒 RNA 聚合酶在真核细胞中的表达及亚细胞定位
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 质粒、菌株和细胞株
• 1.1.2 主要试剂
• 1.1.3 主要仪器
• 1.2 方法
• 1.2.1 引物的设计与合成
• 1.2.2 表达质粒构建
• 1.2.3 MDCK 细胞的转染
• 1.2.4 融合蛋白表达的 Western blot 检测
• 1.2.5 RdRp 在细胞中的定位观察
• 2 结果与分析
• 2.1 重组质粒的构建
• 2.2 RdRp 在真核细胞中的表达
• 2.3 RdRp 在真核细胞中的亚细胞定位
• 3 讨论
• 结论
• 致谢
• 参考文献
• 作者简介
• 导师简介