RNA干扰EGFR基因对卵巢癌细胞生长和化疗敏感性的影响

论文摘要

目的体外构建EGFR基因的小干扰RNA（siRNA）质粒,转染人卵巢癌细胞株skov3后检测RNA干扰（RNAi）对EGFR基因mRNA及蛋白表达水平、细胞的体外生长活性及细胞对化疗药物敏感性的影响。方法根据EGFR mRNA序列设计特异性小发卡状RNA（shRNA）插入序列,体外合成该序列后将其定向克隆入线性化质粒pSilencerTM 2.1-U6 neo,利用DNA测序证明插入序列的正确性。利用HifectinⅡ真核转染试剂将重组质粒转染至skov3细胞中。实验分为三组:正常对照组;非特异性转染组和EGFR shRNA转染组。利用逆转录聚合酶链反应（RT-PCR）和免疫细胞化学（ICC）方法分别鉴定转染前后EGFR基因在mRNA和蛋白水平表达的变化;利用四甲基偶氮唑蓝法（MTT）测定转染前后细胞增殖活性的改变以及细胞对顺铂敏感性的变化。结果双向重复DNA测序证实EGFR质粒表达载体中shRNA插入序列完全正确。RT-PCR和ICC的结果也证明此表达载体可特异性抑制EGFR基因的表达,EGFR shRNA转染组细胞EGFR mRNA的表达与其他两组相比明显减弱（F=87.73,q=1.50～16.81,P＜0.01）;EGFR蛋白表达亦明显下调（F=69.29,q=1.14～14.71,P＜0.01）;细胞的增殖活性受到抑制,生长缓慢,与正常对照组相比,第五天的抑制率达到30%;体外培养的细胞对顺铂敏感性比正常对照组提高了约3倍。结论利用RNAi技术设计并体外合成靶向EGFR的序列特异性shRNA转染人卵巢癌细胞株skov3细胞后可有效抑制skov3细胞中EGFR基因在mRNA和蛋白水平的表达,同时可以抑制skov3细胞的体外生长活性,增强skov3细胞对顺铂的敏感性。

论文目录

• 中文摘要
• Abstract
• 引言
• 第一章 实验材料
• 1.1 质粒、菌株、细胞株
• 1.2 主要试剂
• 1.3 主要仪器、设备
• 第二章 实验方法
• 2.1 细胞培养
• 2.2 EGFR基因shRNA寡核苷酸序列的设计与合成
• 2.3 EGFR shRNA真核表达质粒的构建、鉴定和纯化
• 2.4 转染
• 2.5 RT-PCR检测转染前后skov3细胞EGFR mRNA的表达
• 2.6 ICC检测转染前后skov3细胞EGFR蛋白的表达
• 2.7 RNAi对细胞增殖的影响
• 2.8 化疗敏感性分析
• 2.9 统计学方法
• 第三章 实验结果
• 3.1 质粒的鉴定
• 3.2 pEGFR-shRNA对细胞EGFR mRNA表达的影响
• 3.3 pEGFR-shRNA对细胞EGFR蛋白质表达的影响
• 3.4 RNAi抑制细胞的增殖
• 3.5 顺铂敏感性的变化
• 第四章 讨论
• 结论
• 参考文献
• 综述
• 综述的参考文献
• 攻读学位期间的研究成果
• 致谢