生防菌B579发酵条件优化及生防效果的研究

论文摘要

枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）是一类广泛存在于自然界的对人类安全的生防细菌,对多种植物病原菌具有拮抗性,而且具有很强的环境适应性,能够产生耐热、抗逆的芽孢,有利于生防菌剂的生产、加工和储存,是一种理想的生防细菌。本论文以前期筛选到的生防细菌——枯草芽孢杆菌B579为研究对象,利用摇瓶发酵对枯草芽孢杆菌B579种子的培养进行了研究。以BYP培养基作为种子培养基,较佳的种子培养条件为：种龄14h,接种量7%。摇瓶发酵过程中最适pH为7.0。对枯草芽孢杆菌B579摇瓶发酵补料策略及补料量进行了优化,结果表明摇瓶发酵条件下葡萄糖反馈补料是最佳补料策略,在发酵的过程中控制葡萄糖浓度为3.0g/L-6.0g/L,发酵结束菌体浓度为9.5×109CFU/mL,为优化前的1.9倍。为了得到较优的芽孢生成条件,本论文采用LB培养基建立了两步发酵控制策略,在第一阶段（0-10h）促进菌体生长,第二阶段（10h-30h）促进芽孢生成。分别考察了培养基初始葡萄糖浓度、发酵过程pH、第二阶段摇床转速、第二阶段发酵温度对芽孢生成的影响。利用正交实验确定了获得高浓度芽孢的最佳发酵条件为：培养基初始葡萄糖浓度5.0g/L,发酵过程pH7.0,第一阶段的培养温度37℃,摇床转速180r/min,第二阶段发酵温度40℃,摇床转速为200r/min。此条件下发酵30h后获得的芽孢浓度为9.4×108CFU/mL,芽孢生成率为91.0%,分别是优化前的6.7倍和2.4倍。其中培养基初始葡萄糖浓度是影响芽孢生成的显著因素。在摇瓶发酵研究的基础上进行7L发酵罐分批发酵,在温度37℃,pH为7.0条件下,发酵30h,菌体浓度为1.1×1010CFU/mL。在温度37℃条件下,进行补料-分批发酵,发酵过程中调节pH维持在7.0,溶氧为10%左右,发酵过程中补加葡萄糖,使葡萄糖浓度保持在3.0-6.0g/L,发酵35h,菌体浓度达到了3.9×1010CFU/mL,是分批发酵菌体浓度的3.8倍。将优化后芽孢生成条件应用于7L发酵罐,发酵结束芽孢浓度达到了2.8×1010CFU/mL,芽孢生成率为75%。采用喷雾干燥法制备了枯草芽孢杆菌B579粉制剂,并利用杯碟法对其抑菌效果进行了比较。温室盆栽实验表明B579处理使黄瓜的出苗率提高了15%,苗期株高和鲜重分别增加了40%和30%,植株活力指数增加了49%,对黄瓜枯萎病的生防效果达73.6%,说明生防菌B579不仅可以有效抑制黄瓜枯萎病,而且对黄瓜植株有明显的促生长作用。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 1 前言
• 1.1 土传病害
• 1.2 生防细菌及其种类
• 1.2.1 Bacillus属细菌
• 1.2.2 Agrobacterium属细菌
• 1.2.3 Pseudomonas属细菌
• 1.2.4 Pasteurella属细菌
• 1.3 枯草芽孢杆菌抑菌机理
• 1.3.1 枯草芽孢杆菌的拮抗作用
• 1.3.2 竞争和定殖作用
• 1.3.3 诱导抗性
• 1.3.4 促生长作用
• 1.4 草芽孢杆菌作为生防因子的研发概况
• 1.4.1 国外枯草芽孢杆菌的应用状况
• 1.4.2 国内枯草芽孢杆菌的研究概况
• 1.5 生防细菌发酵培养的研究
• 1.5.1 发酵培养基的优化
• 1.5.2 发酵条件的优化
• 1.5.3 芽孢生成条件的优化
• 1.6 枯草芽孢杆菌芽孢的生成
• 1.6.1 芽孢的生成
• 1.6.2 芽孢的结构
• 1.6.3 芽孢的特性
• 1.6.4 芽孢的用途
• 1.7 课题研究背景及意义
• 1.8 本论文的研究内容
• 2 实验材料与方法
• 2.1 实验材料
• 2.1.1 菌种
• 2.1.2 培养基
• 2.1.3 主要实验试剂
• 2.1.4 主要实验仪器
• 2.2 实验方法
• 2.2.1 菌种培养方法
• 2.2.2 枯草芽孢杆菌B579接种条件的优化
• 2.2.3 枯草芽孢杆菌B579摇瓶发酵条件的优化
• 2.2.4 枯草芽孢杆菌B579芽孢生成条件的优化
• 2.2.5 金属离子对芽孢生成的影响
• 2.2.6 发酵罐放大培养
• 2.2.7 生防菌B579粉制剂的制备
• 2.2.8 生防菌B579生防效果的研究
• 2.3 分析方法
• 2.3.1 菌体浓度的测定
• 2.3.2 活菌总数的测定
• 2.3.3 芽孢浓度的测定
• 2.3.4 芽孢生成率
• 2.3.5 pH仪测量发酵过程pH
• 2.3.6 生物传感分析仪测量葡萄糖残糖
• 2.3.7 总糖的测定-蒽酮比色法
• 2.3.8 DNS法测发酵液中可溶性还原糖
• 2.3.9 发酵液氨基氮的测定
• 2.3.10 病情指数分析
• 2.4 数据分析及统计
• 3 结果与讨论
• 3.1 生防菌B579的菌体形态
• 3.2 种子培养条件的优化
• 3.2.1 种子培养基对生防菌B579发酵的影响
• 3.2.2 接种量对生防菌B579生长的影响
• 3.2.3 种龄对生防菌B579生长的影响
• 3.3 生防菌B579摇瓶发酵过程分析
• 3.4 生防菌B579摇瓶发酵条件的优化
• 3.4.1 发酵过程中pH的确定
• 3.4.2 摇瓶补料方式对生防菌B579发酵的影响
• 3.5 枯草芽孢杆菌B579发酵过程中芽孢生成条件的优化
• 3.5.1 枯草芽孢杆菌B579在LB培养基中的生长曲线
• 3.5.2 通过两步控制策略优化芽孢生成条件
• 3.5.3 金属离子对芽孢生成的影响
• 3.6 发酵罐放大培养
• 3.6.1 B579发酵罐分批发酵
• 3.6.2 发酵罐补料分批发酵
• 3.6.3 芽孢生成条件的发酵罐放大
• 3.7 粉制剂活菌数的测定
• 3.8 生防效果的测定
• 3.8.1 平板对峙试验
• 3.8.2 盆栽试验
• 4 结论
• 5 展望
• 6 参考文献
• 7 硕士期间发表论文
• 8 致谢