禽多杀性巴氏杆菌OMPs、LPS和灭活疫苗的制备与免疫

论文摘要

本论文着重研究了禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白（OMPs）和脂多糖（LPS）的提取和纯化以及禽多杀性巴氏杆菌的灭活,在此基础上研制出了禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白疫苗、脂多糖疫苗和灭活疫苗,并进行了免疫保护试验,主要研究内容和结果如下:采用溶菌酶法、液氮研磨法和超声波法提取禽多杀性巴氏杆菌外膜蛋白,考马斯亮蓝G-250法测定蛋白浓度,之后进行SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳,用凝胶分析软件Quantity One分析电泳条带。结果显示,溶菌酶法、液氮研磨法和超声波法三种方法所提外膜蛋白溶液的蛋白浓度分别为242μg/mL、1013μg/mL和1770μg/mL。通过电泳分析,三种方法提取的OMPs图谱大致相同,每个泳道都含有28.7 kD、35.6 kD和40.3 kD三条主要的蛋白多肽,其中35.6 kD的蛋白含量最多。采用热酚水法和苯酚/氯仿/石油醚法（PCP法）提取禽多杀性巴氏杆菌脂多糖,苯酚-硫酸法测定所提脂多糖溶液中多糖含量,考马斯亮蓝G-250法测其中蛋白含量。结果显示,热酚水法所提溶液中脂多糖浓度为2056μg/mL,PCP法为681μg/mL,但热酚水法提取的LPS溶液中蛋白浓度为31μg/mL,是多糖含量的1.5%,PCP法提取的LPS溶液中蛋白浓度为9μg/mL,为多糖含量的1.3%。研究禽多杀性巴氏杆菌灭活时最佳甲醛含量,并将灭活菌液与弗氏完全佐剂混合制备出禽多杀性巴氏杆菌油乳剂灭活疫苗。结果表明,当甲醛含量为0.2%,37℃作用2 h后,可杀死全部巴氏杆菌,所制备的油乳剂灭活疫苗黏度、稳定性和安全性均符合要求。制备出禽多杀性巴氏杆菌OMPs疫苗、LPS疫苗和灭活疫苗,进行动物免疫,小白鼠分为五组:OMPs组、LPS组、灭活疫苗组、禽多杀性巴氏杆菌病弱毒活疫苗组和PBS对照组,每组16只。各组均免疫三次,每次间隔两周。间接ELISA检测免疫后小白鼠血清特异性抗体水平,MTT法检测小白鼠脾淋巴细胞增殖情况。强毒攻击,计算小白鼠死亡数及保护率。动物免疫后,OMPs组、LPS组和灭活疫苗组免疫小白鼠血清抗体水平持续上升,与弱毒活疫苗组水平相当,与PBS组相比差异显著（P<0.05）。脾淋巴细胞增殖试验表明,OMPs组、LPS组、灭活疫苗组和弱毒活疫苗组的SI值极显著高于PBS对照组（P<0.01）,但四疫苗组之间则无明显差异（P>0.05）。攻毒保护试验结果显示,OMPs疫苗的保护率与弱毒活疫苗相当,为80%,高于LPS疫苗和灭活疫苗的保护率（70%）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 第1章 文献综述
• 1.1 禽巴氏杆菌病的流行与危害
• 1.1.1 病原学
• 1.1.2 流行病学
• 1.1.3 临床症状和病理变化
• 1.1.4 诊断方法
• 1.2 多杀性巴氏杆菌毒力因子及免疫原研究进展
• 1.2.1 荚膜
• 1.2.2 外膜蛋白
• 1.2.3 脂多糖
• 1.3 禽巴氏杆菌病疫苗研究进展
• 1.3.1 灭活疫苗
• 1.3.2 弱毒疫苗
• 1.3.3 亚单位疫苗
• 1.3.4 DNA 疫苗
• 1.4 本研究所采用的技术路线
• 第2章 禽多杀性巴氏杆菌 OMPs 和 LPS 的提取
• 2.1 材料
• 2.1.1 试验用菌株
• 2.1.2 主要试剂
• 2.1.3 试验仪器
• 2.1.4 培养液及培养基
• 2.2 方法
• 2.2.1 OMPs 提取
• 2.2.2 LPS 提取
• 2.2.3 OMPs 中蛋白含量测定
• 2.2.4 SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳
• 2.2.5 LPS 中物质含量测定
• 2.3 结果与分析
• 2.3.1 OMPs 中蛋白含量测定结果
• 2.3.2 SDS-PAGE 结果
• 2.3.3 LPS 中物质含量测定结果
• 2.4 讨论
• 第3章 禽多杀性巴氏杆菌灭活疫苗的制备
• 3.1 材料
• 3.1.1 试验用菌株
• 3.1.2 实验动物
• 3.1.3 主要试剂
• 3.1.4 培养液及培养基
• 3.1.5 仪器设备
• 3.2 方法
• 3.2.1 细菌生长曲线的测定
• 3.2.2 灭活时甲醛含量的选择
• 3.2.3 疫苗的制备
• 3.2.4 疫苗的无菌检验
• 3.2.5 疫苗物理性状检查
• 3.2.6 疫苗的安全性检验
• 3.3 结果与分析
• 3.3.1 绘制细菌生长曲线
• 3.3.2 甲醛含量的确定
• 3.3.3 疫苗的无菌检验
• 3.3.4 疫苗的物理性状
• 3.3.5 疫苗的安全性
• 3.4 讨论
• 第4章 禽多杀性巴氏杆菌 OMPs 疫苗、LPS 疫苗和灭活疫苗的免疫效果
• 4.1 材料
• 4.1.1 菌种
• 4.1.2 实验动物
• 4.1.3 主要试剂
• 4.2 方法
• 50)测定'>4.2.1 禽多杀性巴氏杆菌半数致死量(LD₅₀)测定
• 4.2.2 疫苗的制备
• 4.2.3 动物免疫
• 4.2.4 免疫小白鼠血清抗体检测
• 4.2.5 免疫小白鼠脾淋巴细胞增殖试验
• 4.2.6 攻毒保护试验
• 4.3 结果与分析
• 50 测定'>4.3.1 禽多杀性巴氏杆菌LD₅₀测定
• 4.3.2 ELISA 抗体检测结果
• 4.3.3 脾淋巴细胞增殖试验结果
• 4.3.4 攻毒试验结果
• 4.4 讨论
• 第5章 结论
• 参考文献
• 缩略语词汇表
• 附录
• 致谢
• 攻读硕士学位期间的研究成果