桑树黄化型萎缩病病原及其响应蛋白的蛋白质组学研究

论文摘要

植原体病害是世界性植物病害,全球范围内均有不同程度的发生,给农林业生产造成巨大损失。桑黄化型萎缩病是桑树上的重大病害,常导致大片桑树毁灭,严重制约了蚕业生产的发展。由于植原体难以培养,对于植原体的研究进展缓慢,关于植原体诱导植物发病的分子机制知之甚少。自从植原体基因组序列测定完成后,基因组学的研究重心便从揭示植原体的所有遗传信息转移到从整体水平上对植原体的生物过程进行研究,特别是对基因组注解的验证性研究,而蛋白质组学研究便是其中的一项重要的内容。近年来对于桑树黄化型萎缩病发生分子机制的研究并没有取得实质性的进展,桑树萎缩病病原响应蛋白的研究在国内外尚未见报道。本研究通过对植原体蛋白质组学及桑树萎缩病病原响应蛋白的研究,以期为从分子水平上揭示桑树萎缩病的发生机理提供理论基础。本研究利用Shotgun策略对植原体表达的蛋白质组进行了分析。结合SDS-PAGE电泳与毛细管液相色谱-串联质谱技术,准确地鉴定了242种植原体蛋白质,其中包括参与氨基酸合成、细胞膜、中间代谢、细胞过程、能量代谢、不饱和脂肪酸和磷脂的代谢、核苷及核苷酸代谢、复制、转录、翻译、运输和结合蛋白和其它功能的相关蛋白质。除了上述已知功能的蛋白外,还鉴定了76种假定蛋白或保守的假定蛋白。所鉴定的蛋白质总量占预测的植原体蛋白质组的35%。如此大通量地对植原体蛋白质组进行鉴定国内外还未见报道,该研究不仅为植原体蛋白质组学研究提供了技术参考,同时提供了一个具有参考价值的植原体蛋白质数据库,为更好地理解植原体的生物过程的功能和机制奠定了基础。本研究结合蛋白质双向凝胶电泳和质谱技术,利用差异蛋白质组学策略研究了桑树受植原体侵染后叶片蛋白表达谱的变化。利用ImageMasterTM 2D Platinum软件分析,共检测到500多个叶片可溶性蛋白,发现有37个蛋白点差异表达,其中18个被下调,19个被上调。质谱分析共鉴定出18个蛋白点,代表了15种不同的蛋白。被鉴定的蛋白包括Rubisco大亚基、景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶、Rubisco活化酶、防御相关蛋白、蛋白酪氨酸磷酸化酶、NUDIX/mutT类水解酶家族蛋白、成熟酶K、Kunitz型蛋白酶抑制剂-1、20S蛋白酶体亚基、放氧复合体的33 kDa前体蛋白、苹果酸脱氢酶、甲硫氨酸亚砜还原酶、Gm-ck32857、F-box蛋白、未知蛋白。这些蛋白涉及到光合作用、氨基酸代谢、核苷酸代谢、信号传导及调控、防御应答、转录等多个生理过程。本研究为从分子水平上揭示桑树萎缩病的发生机理提供了理论基础。景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶（SBPase）是卡尔文循环过程中的关键酶。本研究利用RACE技术得到桑树景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因全长cDNA,命名为MSBPase （GenBank登录号:DQ995346）。MSBPase全长为1 527 bp,该序列含有一个1 179 bp的完整开放读码框,编码393个氨基酸,蛋白质理论分子量约为42.6 kDa,等电点为5.85,其氨基酸序列与其它植物中已分离的SBPase有很高的同源性。对MSBPase编码的蛋白质（命名为MSBPase）进行结构预测分析表明,该蛋白富含无规卷曲（Coil）,高达64.29%,其次是α-螺旋（Helix）,为22.19 %,而β-折叠（Strand）只有13.52 %。将MSBPase编码区插入原核表达载体pET30a （+）,并转化到大肠杆菌菌株BL21中,经过IPTG诱导,MSBPase融合蛋白在BL21菌株中成功表达。将得到的MSBPase编码区插入植物表达载体pBI121中,构建了MSBPase植物表达载体pBI121-SBP。将植物表达载体pBI121-SBP,采用农杆菌介导的方法,转化拟南芥,经卡那霉素筛选获得若干再生植株。经Northern和Western杂交分析,证明MSBPase在转基因拟南芥中已成功得到表达。MSBPase在拟南芥中超表达可以提高拟南芥叶片的SBPase活性和净光合速率,叶片淀粉和可溶性糖含量增加,植物生长旺盛,干物质积累增加,开花提前。本研究为桑树基因工程提供了有效的候选基因,为深入研究SBPase的分子调控机制奠定了基础。1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶（RCA）广泛存在于光合生物中,它是一种由核基因编码的叶绿体蛋白,具有调节Rubisco活性的功能。本研究根据RCA的保守区域设计一对兼并引物,通过PCR扩增,获得RCA的基因功能区的中间片段,利用RACE技术获得RCA的基因cDNA的3’端片段。对获得的基因片段所编码的氨基酸进行BLAST分析,结果表明,其与GenBank中报道的其它植物来源的RCA有较高的同源性。RCA的部分编码区插入原核表达载体pET30a（+）,并转化到大肠杆菌菌株BL21中。经过IPTG诱导,RCA的部分编码区在BL21菌株中成功表达。将得到的RCA基因片段反向插入植物表达载体,构建了RCA基因反义表达载体pBI121-RCA。本研究为深入研究光合作用的机理以及阐明RCA与1,5-二磷酸核酮糖羧化酶相互作用和调控关系奠定了基础。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 第一章 文献综述
• 1 桑树黄化型萎缩病的研究进展
• 1.1 桑树黄化型萎缩病病症研究
• 1.2 桑黄化型萎缩病病原研究
• 1.2.1 桑树黄化型萎缩病病原的发现
• 1.2.2 桑树黄化型萎缩病病原的特性
• 1.2.3 桑树黄化型萎缩病病原的分离、保存
• 1.2.4 桑树黄化型萎缩病病原检测
• 1.2.5 桑树黄化型萎缩病病原的分类
• 1.3 桑树黄化型萎缩病发病机理的研究
• 1.4 桑黄化型萎缩病的传染途径与流行规律研究
• 1.4.1 桑树黄化型萎缩病的传染途径
• 1.4.2 桑树黄化型萎缩病发生、流行的影响因素
• 1.5 桑树黄化型萎缩病的防治技术研究
• 1.5.1 桑树黄化型萎缩病药物防治技术
• 1.5.2 桑品种抗病性鉴定技术
• 1.5.3 无病良种桑苗培育技术
• 1.5.4 治虫防病技术
• 1.5.5 桑树肥水管理和采伐技术
• 1.5.6 其它防治技术
• 1.6 问题与展望
• 2 植物逆境胁迫差异蛋白质组学研究进展
• 2.1 蛋白质组差异的产生原因及其表现形式
• 2.2 差异蛋白质组学的研究方法
• 2.2.1 双向电泳
• 2.2.2 用于蛋白质定量和比较研究的质谱相关技术
• 2.2.3 表面增强激光解吸离子化飞行时间质谱（SELDI）技术
• 2.2.4 HPLC 及CE 技术
• 2.2.5 SELDI 蛋白质芯片技术
• 2.2.6 生物信息学分析
• 2.3 差异蛋白质组学在植物非生物胁迫研究中的进展
• 2.3.1 干旱胁迫
• 2.3.2 盐渍胁迫
• 2.3.3 低温胁迫
• 2.3.4 机械损伤
• 2.3.5 营养胁迫
• 2.3.6 缺氧和其他非生物胁迫
• 2.4 差异蛋白质组学在植物生物胁迫研究中的进展
• 2.4.1 植物与共生微生物的关系
• 2.4.2 植物与病原微生物的关系
• 2.5 植物差异蛋白质组学面临的主要问题和展望
• 3 景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶研究进展
• 3.1 SBPase 的生物化学研究
• 3.2 SBPase 的分子生物学研究
• 3.3 SBPase 的结构研究
• 3.4 SBPase 基因的表达调控研究
• 3.5 SBPase 的基因工程研究
• 3.6 问题与展望
• 4 Rubisco 活化酶研究进展
• 4.1 Rubisco 活化酶的分子特性
• 4.2 Rubisco 活化酶对Rubisco 的活化机制
• 4.3 环境因素对Rubisco 活化酶的影响
• 4.3.1 温度
• 2'>4.3.2 CO₂
• 4.3.3 光
• 4.3.4 其它
• 4.4 植物生长发育时期、品种和组织间Rubisco 活化酶的活性和表达差异
• 4.5 Rubisco 活化酶的基因工程
• 4.6 问题与展望
• 5 本研究的目的意义
• 第二章 桑树黄化型萎缩病病原—植原体蛋白质组 Shotgun 策略分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 其它材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 桑树黄化型萎缩病病株透射电镜检测
• 1.2.2 桑树黄化型萎缩病植原体的PCR 检测及进化树分析
• 1.2.2.1 桑树叶片DNA 的提取
• 1.2.2.2 桑树黄化型萎缩病病原—植原体的PCR 检测
• 1.2.2.3 目的片段的回收
• 1.2.2.4 目的片段与克隆载体的连接
• 1.2.2.5 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 1.2.2.6 大肠杆菌细胞的转化
• 1.2.2.7 阳性克隆质粒的鉴定
• 1.2.2.8 序列测定
• 1.2.2.9 序列比对分析、进化树绘制
• 1.2.3 植原体的提取与纯化
• 1.2.4 植原体纯化物的电子显微镜检测
• 1.2.5 植原体蛋白质的提取
• 1.2.6 植原体蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.7 植原体蛋白质组的Shotgun 分析
• 1.2.7.1 胶内酶解
• 1.2.7.2 毛细管高效液相色谱
• 1.2.7.3 质谱检测及蛋白鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 桑树黄化型萎缩病病症
• 2.2 桑树黄化型萎缩病病原的PCR 检测及其进化树分析
• 2.3 桑树黄化型萎缩病病原的电子显微镜检测
• 2.4 纯化的植原体的电镜检测
• 2.5 植原体蛋白质组的SDS-PAGE 分析
• 2.6 植原体蛋白质组的Shotgun 分析
• 3 小结
• 4 讨论
• 4.1 植原体的能量代谢
• 4.2 植原体的毒力因子
• 4.3 植原体假定蛋白
• 第三章 桑树黄化型萎缩病病原响应蛋白的蛋白质组学分析
• 1 材料与方法
• 1.1 植物材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 叶片超薄切片透射电镜观察
• 1.2.2 桑树叶片蛋白质的提取
• 1.2.3 蛋白质的纯化
• 1.2.4 蛋白质的定量
• 1.2.5 桑树叶片蛋白质的聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）
• 1.2.6 桑树叶片蛋白质的双向电泳
• 1.2.6.1 第一向等电聚焦电泳
• 1.2.6.2 IPG 胶条的平衡
• 1.2.6.3 灌胶
• 1.2.6.4 第二向SDS 电泳
• 1.2.6.5 染色、脱色
• 1.2.7 图象的扫描和分析
• 1.2.8 差异点的胶内酶解
• 1.2.9 MALDI-TOF-MS 质谱分析与数据检索
• 1.2.10 MALDI-TOF/ TOF-MS 质谱分析与数据检索
• 1.2.11 质谱鉴定的差异表达蛋白的功能分类分析
• 1.2.12 叶绿素含量的测定
• 1.2.13 叶片净光合速率的测定
• 1.2.14 叶片羧化效率的测定
• 1.2.15 荧光参数测定
• 1.2.16 Rubisco 活性的测定
• 1.2.17 SBPase 活性的测定
• 1.2.18 桑树叶片可溶性糖及淀粉含量的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 植原体侵染对桑树叶片超微结构的影响
• 2.2 植原体侵染对桑树生理生化特性的影响
• 2.2.1 植原体侵染对桑树叶片叶绿素含量的影响
• 2.2.2 植原体侵染对桑树叶片光合能力的影响
• 2.2.3 植原体侵染对桑树叶片羧化效率的影响
• 2.2.4 植原体侵染对桑树叶片荧光参数的影响
• 2.2.5 植原体侵染对桑树叶片淀粉及可溶性糖含量的影响
• 2.2.6 植原体侵染对桑树叶片SBPase 和Rubisco 活性的影响
• 2.3 桑树叶片的蛋白质单向电泳分析
• 2.4 桑树叶片蛋白质的双向电泳分析
• 2.5 差异表达蛋白点的质谱鉴定
• 3 小结
• 4 讨论
• 4.1 植原体侵染促进叶绿体蛋白的降解
• 4.2 病原响应蛋白的主要生理功能
• 4.3 桑树黄化型萎缩病的发病机制
• 第四章 桑树黄化型萎缩病病原响应蛋白—景天庚酮糖-1,7-二磷酸酶基因的克隆与表达分析
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.1.1 植物材料
• 1.1.2 PCR 引物
• 1.1.3 载体
• 1.1.4 其它材料
• 1.2 方法
• 1.2.1 MSBPase 的克隆
• 1.2.1.1 总RNA 的提取
• 1.2.1.2 cDNA 的合成
• 1.2.1.3 MSBPase 中间片段的克隆
• 1.2.1.4 MSBPase 的3'RACE
• 1.2.1.5 cDNA 同聚物加尾反应
• 1.2.1.6 MSBPase 的5'RACE
• 1.2.1.7 MSBPase cDNA 编码区全长序列的获得
• 1.2.1.8 目的片段的回收
• 1.2.1.9 目的片段与克隆载体的连接
• 1.2.1.10 大肠杆菌DH5α感受态的制备
• 1.2.1.11 大肠杆菌细胞的转化
• 1.2.1.12 质粒DNA 的提取
• 1.2.1.13 阳性克隆质粒的鉴定
• 1.2.1.14 序列测定
• 1.2.2 MSBPase 序列分析
• 1.2.3 MSBPase 所编码的蛋白质特性分析
• 1.2.4 原核表达载体的构建与鉴定
• 1.2.5 MSBPase 融合蛋白诱导表达与SDS-PAGE 电泳分析
• 1.2.6 MSBPase 植物表达载体的构建与鉴定
• 1.2.7 农杆菌GV3101 感受态细胞制备及转化
• 1.2.8 拟南芥的无土栽培、转化
• 1.2.8.1 拟南芥的无土栽培
• 1.2.8.2 拟南芥转化方法
• 1.2.9 转基因植株的PCR 鉴定
• 1.2.10 Northern 杂交分析
• 1.2.10.1 总RNA 的提取
• 1.2.10.2 甲醛变性凝胶电泳
• 1.2.10.3 转膜
• 1.2.10.4 预杂交
• 1.2.10.5 探针的制备
• 1.2.10.6 杂交
• 1.2.10.7 洗膜
• 1.2.10.8 放射自显影
• 1.2.11 Western 杂交分析
• 1.2.11.1 抗体的制备
• 1.2.11.2 抗血清效价的测定（试管微量沉淀法）
• 1.2.11.3 Western 杂交
• 1.2.12 转基因植株的表型分析及相关生理生化指标的测定
• 1.2.12.1 植株干重的测定
• 1.2.12.2 转基因植株其它生理生化指标的测定
• 2 结果与分析
• 2.1 MSBPase 的体外扩增与克隆
• 2.2 MSBPase 的序列分析
• 2.3 MSBPase 所编码的蛋白质特性分析
• 2.3.1 MSBPase 所编码的蛋白质结构分析
• 2.3.2 MSBPase 所编码的蛋白质结构功能保守区和功能结构域分析
• 2.3.3 疏水性分析
• 2.3.4 跨膜区分析
• 2.3.5 前导肽和定位分析
• 2.4 原核表达载体的构建
• 2.5 pET30a-SBP 融合蛋白的诱导和抗体制备
• 2.6 植物表达载体构建
• 2.7 桑树MSBPase 基因在拟南芥中超表达及转基因拟南芥的筛选
• 2.7.1 转基因拟南芥的PCR 鉴定
• 2.7.2 转基因植株的Northern 杂交
• 2.7.3 转基因植株的Western 杂交
• 2.8 转MSBPase 基因拟南芥植株的生理生化特性分析
• 2.8.1 转MSBPase 基因拟南芥植株的表型分析
• 2.8.2 转MSBPase 基因拟南芥植株的其他特性分析
• 3 小结
• 4 讨论
• 4.1 SBPase 对于植物生长发育的影响
• 4.2 SBPase 的进化分析
• 第五章 桑树黄化型萎缩病病原响应蛋白-1,5-二磷酸核酮糖羧化酶活化酶cDNA 片段的克隆、原核表达与植物反义表达载体的构建
• 1 材料与方法
• 1.1 材料
• 1.2 RNA 的提取及cDNA 的合成
• 1.3 RCA 中间片段的克隆
• 1.4 RCA 3'端的克隆
• 1.5 扩增产物的克隆与序列测定
• 1.6 序列分析
• 1.7 原核表达载体的构建
• 1.8 RCA 片段所编码的蛋白原核诱导表达与SDS-PAGE 电泳分析
• 1.9 RCA 植物反义表达载体的构建与鉴定
• 2 结果与分析
• 2.1 RCA 片段的体外扩增与克隆
• 2.2 RCA 的序列分析
• 2.3 原核表达载体的构建
• 2.4 RCA 片段编码蛋白的原核诱导表达及抗体制备
• 2.5 RCA 植物反义表达载体的构建与鉴定
• 3 小结
• 4 讨论
• 结论
• 参考文献
• 致谢
• 攻读学位期间发表的主要论文