血浆miRNAs检测诊断胰腺癌的价值分析及miR-196a参与胰腺癌发病的作用机制研究

论文摘要

胰腺癌是一种高度恶性肿瘤,早期缺乏典型症状,发现时多已有周围组织浸润及远处转移,因此预后不良。直径大于30mm的胰腺癌手术切除术后5年生存率为10%～20%,对于直径≤20mm的胰腺癌手术切除术后5年生存率为30%～60%,如果对于微小胰腺癌（直径≤10mm）手术切除术后5年生存率可达75%。因此,提高胰腺癌早期诊断水平是提高手术切除率和延长生存时间的关键。但是现有的诊断标志物对胰腺癌尤其是早期胰腺癌的诊断敏感性较低,这大大限制了胰腺癌的诊断及治疗水平。因此,临床上迫切需要发现新的胰腺癌分子标志物,从而为提高胰腺癌的诊治水平提供新的手段。胰腺癌从根本上来说是一种基因疾病,胰腺癌的发生发展是一个从内皮的非典型增生到原位癌,再到侵袭性肿瘤的过程,其进程是多阶段多步骤的,需要多个基因改变的连续性积累。在这个过程中,控制细胞分化、增殖和凋亡的多个基因出现了异常变化,包括原癌基因的突变或过度表达及抑癌基因的失活,而且miRNAs也参与了与胰腺癌的发病。miRNAs是内源性的非编码RNA分子,由长约18～25个核苷酸组成的非编码的单链RNAs。miRNAs具有抑癌基因与癌基因的双重作用,在细胞增殖、分化和凋亡等方面发挥重要的作用。miRNAs发挥调控作用通常是一种miRNA可以调控多个靶基因,一个靶基因可被多个miRNAs所调控,其调控方式是通过对其靶基因mRNA的转录后表达调节。当miRNA与其靶向mRNA完全或几乎完全互补时,可导致目的mRNA被降解,当miRNA与靶向mRNA不完全互补时,则负调控翻译过程,阻碍蛋白质的翻译。研究表明,肿瘤组织miRNAs的表达谱与肿瘤的类型相关,不同种类的肿瘤具有不同的miRNAs表达谱,因此miRNA可作为肿瘤诊断标志物,而且可用于肿瘤的治疗和预后判断。研究表明miRNA与胰腺癌的生物学特性存在密切关系。Bloomston等应用miRNAs芯片和Rea1-time PCR方法在8个胰腺癌组织和配对的良性胰腺组织中发现miR-21、miR-221、miR-222、miR-18la、miR-181b、miR-181d、miR-l55在胰腺癌组织中显著高表达。Lee等通过miRNA表达谱分析发现miR-221、miR-100、miR-125b、miR-21在胰腺癌组织中高表达,miR-375在胰腺癌组织中表达较正常组织降低。miR-34在胰腺癌细胞株中表达下调,但在HPNE和HPDE两株未转化胰腺导管细胞系中呈高表达。Moriyama等研究发现,miR-21在人胰腺癌细胞株以及胰腺癌组织中显著高表达,在肿瘤细胞中过表达miR-21可增强胰腺癌细胞的增殖、侵袭能力和耐药性,抑制miR-21的表达则相反。MiR-21通过靶向PTEN基因,上调肿瘤侵袭相关基因以及血管内皮生长因子,增强胰腺癌细胞的恶性程度。而且,胰腺癌组织中miR-21的表达水平与胰腺癌患者的预后及生存率相关。研究表明,在大肠癌、乳腺癌、卵巢癌、非小细胞肺癌、前列腺癌及胰腺癌等实体肿瘤中,外周血miRNAs可作为潜在的诊断或预后标志物,还可用于确定肿瘤组织的起源。血浆中miRNAs来源于肿瘤组织,其表达异常可反应肿瘤的进展,并可能用于肿瘤的诊断,然而循环miRNAs的诊断价值目前仍不清楚。在目前已知的人类miRNA中,在胰腺癌组织中高表达的miRNA有10余种,文献报道以及前期研究表明胰腺癌组织中及血浆中miR-196a的高表达与胰腺癌不良预后相关。但miR-196a参与胰腺癌发生及进展调控的机制目前尚不清楚,而且其调控的靶基因亦不清楚。基于上述研究现状,本课题通过miRNAs microarray荧光标记,建立胰腺癌血浆miRNAs的表达谱;对芯片筛选的胰腺癌血浆差异表达miRNAs在胰腺癌细胞株及胰腺癌组织中检测,进一步验证这些差异表达miRNAs的胰腺癌特异性;在胰腺癌和慢性胰腺炎患者及健康人群的血浆中检测筛选的miRNAs表达水平,以此评估血浆miRNAs对胰腺癌的诊断价值;对已证实的与胰腺癌发病相关的miR-196a,应用基因干预方法（转染miR-196a前体和抑制剂）研究其对胰腺癌细胞株增殖、凋亡等生物学行为的调控作用。本研究包括四部分内容,分述如下。一、胰腺癌患者血浆miRNAs的表达谱研究目的:通过血浆miRNAs芯片分析,获取血浆中胰腺癌发病相关的miRNAs。方法:采用AgilentmiRNA芯片建立胰腺癌血浆miRNAs表达谱,筛选胰腺癌和慢性胰腺炎患者血浆及健康志愿者血浆三组间的差异miRNAs,在Sanger数据库获取差异microRNA调控的所有靶基因,并对靶基因进行GO分析和Pathway分析。结果:对9例胰腺癌、11例慢性胰腺炎和9例健康志愿者血浆进行了miRNAs芯片分析,筛选出146个差异表达miRNAs;通过基因表达趋势分析筛选出31个miRNAs,GO分析和Pathway分析结果表明筛选出的差异microRNA调控的靶基因显著地参与了与癌症发生相关的信号通路,如Pathways in cancer、MAPK signaling pathway、Focal adhesion、Wnt signalingpathway及Pancreatic cancer等诸多信号通路,为胰腺癌发病相关的miRNAs。结论:通过血浆miRNAs芯片分析筛选差异表达miRNAs,并进行基因表达趋势分析及功能分析,可获取胰腺癌发病相关的miRNAs。二、胰腺癌细胞株和胰腺癌组织中miRNAs表达情况目的:在胰腺癌细胞株及组织中验证筛选的差异miRNAs的表达情况,证实差异miRNAs的胰腺癌发病相关性。方法:抽提胰腺癌细胞株及新鲜的胰腺癌手术标本（配对的癌组织和癌旁组织）的RNA,通过Real-time PCR检测芯片筛选的17个miRNAs（miR-16、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a、miR-21、miR-210、miR-20a、miR-26a、miR-142-3p、miR-223、miR-939、miR-1202、miR-1207-5p、miR-1228、miR-1825、miR-1915）在胰腺癌细胞株、28对胰腺癌和癌旁组织中的表达量,分析组织miRNAs与胰腺癌患者临床特征的关系。结果:与正常胰腺组织相比,在SWl990、PaTu8988s、ASPC-1、BxPC-3、CFPAC-1、CPANC-1、PANC-l 7株胰腺癌细胞株中miR-155、miR-196a、miR-1202、miR-1207-5p、miR-1228、miR-1825、miR-1915均呈高表达。而且在PaTu8988s胰腺癌细胞株中17个miRNAs均呈显著高表达（P<0.05）。在胰腺癌组织中miR-16、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a、miR-21、miR-210、miR-142-3p的表达水平显著高于癌旁组织（P<0.05）,而miR-223、miR-939在胰腺癌组织中的表达水平显著低于癌旁组织（P<0.05）。其中,miR-155、miR-196a在胰腺癌细胞株及胰腺癌组织中均显著高表达。癌组织及癌旁组织中miRNAs表达量在胰腺癌患者不同性别中无统计学差异,而且与年龄及血清CA19-9水平无显著相关性。癌组织中miR-26a相对表达量与肿瘤最大直径显著正相关,miR-223表达量与肿瘤最大直径显著负相关,miR-196a、miR-142-3p、miR-1228的表达量与TNM分期显著正相关（P<0.05）;在癌旁组织中,miR-223表达量与肿瘤最大直径显著负相关（P<0.05）,miR-181a、miR-21、miR-210、miR-20a、miR-939、miR-1202、miR-1207-5p、miR-1228、miR-1825、miR-1915的表达量与TNM分期显著正相关（P<0.05）。结论:外周血浆芯片筛选的miRNAs在胰腺癌细胞株及癌组织中亦高表达,组织中miRNAs表达量在不同性别胰腺癌患者中无统计学差异,而且与年龄、血清CA19-9水平无显著相关性,具有作为胰腺癌诊断标志物的潜质。miR-223表达量与肿瘤大小及分期呈负相关,表明胰腺癌组织中的miRNAs表达量可能随着肿瘤的发生及进展而出现变化。三、血浆miRNAs对胰腺癌的诊断价值评估目的:评估血浆miRNAs相对表达量对胰腺癌的诊断价值。方法:对140例胰腺癌和111例慢性胰腺炎以及68例健康体检者血浆进行RNA抽提,通过Realt-time PCR检测miR-16、miR-21、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a和miR-210的表达量,分析miRNAs对胰腺癌的诊断效能及miRNAs与胰腺癌患者临床特征的相关性。结果:胰腺癌组血浆miR-16、miR-21、miR-155、miR-181a、miR-181b、miR-196a和miR-210的表达量显著高于慢性胰腺炎组和健康对照组,而且miR-16和miR-196a可用作胰腺癌与慢性胰腺炎及正常的鉴别诊断。miRNAs与CA19-9联合可提高胰腺癌诊断水平。miR-16和miR-196a与CA19-9联合鉴别胰腺癌与正常的AUC-ROC为0.979 （95% CI: 0.962 - 0.996）,而单独CA19-19诊断的AUC-ROC为0.903（95% CI: 0.860 - 0.946）,单独miRNAs（miR-16+miR196a）的诊断AUC-ROC为0.895（95% CI: 0.850 - 0.939）。miRNAs（miR-16+miR196a）与CA19-9联合诊断胰腺癌的敏感性和特异性分别为92.0%和95.6%。miR-16和miR-196a与CA19-9联合鉴别胰腺癌与慢性胰腺炎的AUC-ROC为0.956 （95% CI: 0.932 - 0.981）,而单独CA19-19诊断的AUC-ROC为0. 897（95% CI: 0.932 - 0.981）,单独miRNA（miR-16+miR196a）诊断的AUC-ROC为0.790（95% CI: 0.735 - 0.845）。miR-16和miR-196a胰腺癌的敏感性和特异性分别为88.4%和96.3%。对于Ⅰ期胰腺癌,miRNAs（miR-16+miR196a）与CA19-9联合诊断的敏感性为85.2%,显著高于CA19-9的诊断敏感性55.6%。结论:血浆miRNAs可用作胰腺癌诊断新型分子标志物,miR-16和miR-196a与CA19-9联合诊断可显著提高早期胰腺癌的敏感性。四、基因干预研究miR-196a对胰腺癌的调控机制目的:基因干预研究miR-196a对胰腺癌细胞株生物学行为的调控作用及机制分析。方法:采用miRNA前体和抑制剂进行瞬时转染和慢病毒稳转染PANC-1细胞株的方式,建立胰腺癌细胞株miR-196a高表达和低表达细胞株,通过定量PCR、Western Blot、细胞增殖实验、流式细胞术等方法研究miR-196a对胰腺癌细胞株增殖、凋亡等生物学行为的作用。同时,分析了miR-196a对其靶基因HOXB8的表达调控作用。结果:PANC-1细胞株转染miR-196a抑制剂组HOXB8 mRNA表达量及HOXB8蛋白表达量显著高于转染miR-196a前体组（P<0.05）。miR-196a前体转染可使胰腺癌细胞株增殖能力强于对照组和miR-196a抑制剂瞬时转染组,而转染miR-196a抑制剂组的细胞凋亡率显著高于miR-196a前体组（P<0.05）。结论:miR-196a可促进胰腺癌细胞株增殖,抑制胰腺癌细胞株凋亡,并可调控HOXB8基因的表达。通过上述研究,本课题得出以下结论:1、通过血浆miRNAs芯片分析筛选差异表达miRNAs,并进行基因表达趋势分析及功能分析,可获取胰腺癌发病相关的miRNAs;2、胰腺癌患者血浆中差异表达miRNAs与胰腺癌组织中的表达高度一致,具有胰腺癌发病相关性。组织中miRNAs与患者年龄、性别、血清CA19-9水平无显著相关性。3、血浆miRNAs可用作胰腺癌诊断标志物,miR-16和miR-196a与CA19-9联合可显著提高早期胰腺癌诊断的敏感性。4. miR-196a可促进胰腺癌细胞株增殖,抑制胰腺癌细胞株凋亡,并可调控HOXB8基因的表达。总之,通过血浆miRNAs基因芯片筛查和大样本验证,可以发现新的胰腺癌发病相关miRNAs,血浆miRNAs可作为胰腺癌早期诊断的新型分子标志物,并且miRNAs可参与胰腺癌细胞生物学行为的调控。

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 英文缩略词表
• 前言
• 一、胰腺癌的早期诊断直接影响治疗和预后
• 二、肿瘤组织中高表达的miRNAs可能作为肿瘤标志物
• 三、血浆/血清miRNAs可能用于肿瘤的早期诊断
• 四、胰腺癌的发生与进展伴随着miRNAs异常表达
• 五、血浆/血清miRNAs可能成为胰腺癌早期诊断标志物
• 参考文献
• 第一部分 胰腺癌患者血浆miRNAs 的表达谱研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第二部分 胰腺癌细胞株和胰腺癌组织中miRNAs 表达检测
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第三部分 血浆miRNAs 对胰腺癌的诊断价值分析
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 第四部分 miR-196a 在胰腺癌发病中的作用机制研究
• 材料与方法
• 结果
• 讨论
• 参考文献
• 全文小结
• 综述 miRNAs 对胰腺癌干细胞的调控作用
• 参考文献
• 就读期间发表论文
• 致谢