木薯抗旱相关microRNA差异表达分析

论文摘要

木薯（Manihot esculenta Crantz）为大戟科木薯属植物,是热带地区重要的粮食作物,具有典型的高产、抗逆特征。在我国是淀粉和燃料乙醇生产的重要工业原料。miRNA是一类-21nt,在转录后水平上调节mRNA的非编码RNA。miRNA的调控作用涉及几乎所有重要的生物学过程。本研究是在课题组miRNA前期研究基础上,在木薯抗旱相关miRNA领域的延伸。为了了解miRNA在干旱胁迫环境下的表达模式,本研究采用5个抗旱能力不同的木薯品种,系统地完成了木薯干旱胁迫的生物学过程,并采集并抽提各个时间点植株叶片和根部的RNA样品,并对处理过程中植株的表型变化做了详细记载。选择16个木薯miRNA,对抗旱性差异较大的2个木薯品种进行干旱胁迫处理,并对这16个miRNA进行差异表达分析。结果表明,这些miRNA在品种间和处理间差异表达明显,部分miRNA在特定干旱胁迫条件下具有显著上调或下调的表达特性。具体实验结果如下：（1）定量PCR验证表明,只有1个miRNA在所有干旱胁迫情况下均不表达,其余15个miRNA至少在1个干旱胁迫处理条件下表达,且表达丰度各异。整体而言,相比于对照,miRNA的差异表达主要是上调表达（上调表达占81%,下调表达占19%）。（2）在干旱诱导驯化DA表达,诱导后旱害胁迫DH下也表达,而非诱导伤害DNH不表达的miRNA有6个：1045125,1229496,1230481,3615546,3747522和5178028;只在干旱诱导后伤害DH表达,DA不表达,非诱导伤害DNH不表达的有miR171ab；在干旱诱导后伤害DH与非诱导伤害DNH下均表达的有miR390 b,miR399e,miR4806982和miR6915202等4个。以上miRNA的不同表达形式反应了其所调节的靶机因在应对干旱胁迫中的不同反应机制。（3）表达模式分析发现,15个miRNA在3种干旱处理方式中都有不同的表达模式,具有明显的时序性；在同处理同品种不同部位的比较中,相同表达模式的miRNA数量很少,体现miRNA具有明显的组织特异性,SC124和KU50中,DA处理功能叶和根中相似表达模式的miRNA分别有3个（6915202、3747522、3615546）和5个（1229496、1230481、3615546、4806982、5815094）,DH处理中功能叶和根中相似表达模式的miRNA分别有5个（1229496、4806982、5178028、5815094,3615546）和0个,DNH处理中功能叶和根中相似表达模式的miRNA分别有3个（3615546、4806982、5815094）和1个（398b）；在同处理同部位的六种比较中,品种特异性表现更加明显,SC124和KU50都具有没有1个miRNA是相似的表达模式。（4）本课题组前期研究5个仅在胁迫中表达的miRNA（166a、171ab、390b、398b和399e）,在本实验的干旱胁迫处理中都有表达,验证了这5个miRNA和胁迫诱导的相关性；与前期研究相比,本实验的处理方式、部位和时间点更加细化,结果也更为清晰而深入：在胁迫处理上,5个miRNA在DA中均没有表达,只是在DH和DNH中部分表达；在组织部位上,166a和171ab只在根中有表达,在功能叶中没有表达,只有399e、398b和390b在功能叶和根中都有表达；在胁迫响应时序上,166a在DNH处理的根中第1时间点有表达,而在第2和3时间点都没有表达,其它4个miRNA在3个处理的根或功能叶的3个时间点有明显的表达。（5）利用Hitsensor软件,预测出这16个miRNA和靶mRNA一共有164对miRNA: mRNA互作对。本研究在木薯中进一步收集与干旱相关的miRNA及其靶基因,这些研究成果为今后研究miRNA在木薯的抗旱机制和干旱适应性遗传改良奠定了进一步的基础。

论文目录

• 摘要
• Abstract
• 目录
• 1. 序言
• 1.1 木薯抗旱进展
• 1.1.1 木薯概况
• 1.1.2 旱害对植物的影响
• 1.1.3 木薯抗旱研究进展
• 1.2 miRNA对基因表达的调控
• 1.2.1 miRNA概念与作用机理
• 1.2.2 植物miRNA
• 1.2.3 miRNA生物学功能
• 1.2.3.1 miRNA与生长发育
• 1.2.3.2 miRNA与植物的抗逆性
• 1.3 miRNA的表达特性
• 1.4 miRNA及其靶基因的遗传育种利用
• 1.5 研究目的与意义
• 2. 材料和方法
• 2.1 实验材料
• 2.2 miRNA的差异表达
• 2.2.1 miRNA的获得
• 2.2.1.1 miRNA的计算机预测途径
• 2.2.1.2 miRNA的测序途径
• 2.2.2 miRNA接头以及引物的设计
• 2.2.3 miRNA的提取
• 2.2.4 miRNA的Poly（A）加尾
• 2.2.5 第一链cDNA合成及检测
• 2.2.6 miRNA的表达分析（实时荧光定量PCR）
• 2.3 miRNA靶基因的预测
• 3. 结果与分析
• 3.1 干旱胁迫材料
• 3.1.1 干旱胁迫材料的表型变化与样品采集
• 3.1.2 干旱胁迫材料用于定量表达的选取
• 3.2 木薯逆境相关miRNA序列的获得
• 3.3 miRNA的表达检测
• 3.3.1 cDNA模板的检测（RT-PCR）
• 3.3.2 miRNA的表达检测
• 3.3.2.1 cDNA模板的优化
• 3.3.2.2 miRNA的表达检测（实时荧光定量PCR）
• 3.4 miRNA的表达分析
• 3.4.1 miRNA的表达模式的确定
• 3.4.2 miRNA的表达的数据整理
• 3.4.3 miRNA的表达水平分析
• 3.4.4 miRNA的表达模式分析
• 3.4.5 7个木薯抗旱相关重要miRNA表达规律
• 3.5 木薯干旱相关miRNA的靶基因预测
• 4. 讨论
• 4.1 驯化和非驯化材料选择
• 4.2 与本课题组前期验证的miRNA表达对比
• 4.3 已知功能的miRNA在干旱处理中的表达
• 4.4 miRNA的去抑制作用
• 4.5 miRNA的靶基因预测
• 结论
• 参考文献
• 附录1 16个miRNA在三种处理两个部位中的表达柱状图
• 附录2 16个miRNA的表达柱状图
• 发表论文
• 致谢