论文摘要
背景和目的脑出血的病理生理学变化是一相当复杂的过程，涉及血肿的占位性损害、血液成分及其裂解产物的毒性损害，以及兴奋性氨基酸（EAA）的毒性作用等不同作用机制而引起的损伤级联反应，该反应大都从兴奋毒性开始，兴奋毒性是下游事件的触发者，是脑细胞缺血后损伤最关键，最重要的环节，其中，兴奋性氨基酸受体NMDA（N-甲基-D-门冬氨酸）的亚基NR1的激活是兴奋毒性的核心，因NR1可以直接或间接启动电压依赖性通道，引起Ca2+大量内流，造成迟发性的神经元变性坏。而兴奋性氨基酸受体AMPA（a-氨基3-羟基5-甲基4-异恶唑丙酸）的亚基GluR2主要是抑制Ca2+内流发挥脑保护作用。拉莫三嗪（LTG）主要用于难治性癫痫的治疗，近年来发现其有拮抗EAA兴奋性毒性作用，具体机制仍不太清楚。目前国内外有关脑出血后NR1、GluR2的对比变化，以及与LTG相结合对神经元的保护与损伤机制的文献尚无报道。本实验通过建立大鼠脑出血模型，采用免疫组织化学法、干湿重法分别检测血肿周围、皮质处不同时间点NR1、GluR2的表达及脑组织含水量的动态变化，以及LTG对NR1、GluR2、脑水肿三者的干预情况。以探讨NR1、GluR2、LTG对神经元的保护与损伤机制，为研究EAA的兴奋性毒性提供实验依据、治疗及思路。材料与方法1．实验动物和分组健康成年雄性Wistar大鼠72只，体重220～250g，由郑州大学实验动物中心提供，合格证号：SYK2006-11。随机分为组8只，手术组32只，治疗组32只。后两组又分为12h、1d、3d、7d四个时间点进行HE染色、免疫组织化学染色和脑组织含水量检测，每组每个时间点为8只大鼠。2．脑出血模型的制作和成功的标志大鼠经10％水合氯醛（400mg／kg）腹腔注射麻醉后，俯卧位固定于立体定位仪上，用微量进样器由股动脉抽取血液50μl缓慢注入尾状核位置，留针15min。对照组注入等量生理盐水。动物麻醉清醒后，参照Zea longa等评分标准，累积1分以上为成功模型。3．组织切片的制备实验大鼠断头取脑后，冠状面切取针道后约3mm厚的脑片。常规固定、脱水、石蜡包埋制成4μm切片，进行苏木精-伊红（HE）染色和免疫组化检测。4．指标检测4．1 HE染色：光学显微镜下观察脑组织病理变化。4．2 NR1、GluR2进行免疫组织化学染色，采用SP法，严格按试剂盒使用说明书进行操作。阳性细胞的胞膜或胞浆被染成棕黄色。5．图像分析每只大鼠连续切片，每5张抽取一张切片，对其选取5个不同区域进行高倍镜（400×）观察，应用图像分析系统对阳性区面积平均积分光密度进行定量分析。6．脑组织含水量的测定实验大鼠断头取脑后，取进针道前约3mm厚的脑组织。用电子天平先称取湿重，电热恒温培养干燥两用箱100℃烘烤48h，再称取干重。利用脑组织含水量=（湿重-干重）／湿重×100％进行计算。7．统计学方法所有数据以（?）±s表示，计数资料组间比较用方差分析重复测量法，数据处理采用SPSS12.0软件进行分析。以a=0.05作为显著性检验水准。结果1．脑组织形态学的改变手术组组织切片HE染色，脑出血后12h、1d时可见血肿周围、皮质处神经细胞稀疏，胞体肿胀，3d时表现最明显，细胞变形坏死，胞浆红染明显加深。7d时细胞肿胀减轻，有少量胶质细胞增生；治疗组在组织形态学的改变上较组明显减轻。对照组在12h～7d间变化不明显。2．NR1、GluR2的动态变化对照组：大鼠皮层区的神经元都有弱阳性和部分中等强度表达，阳性细胞胞膜反应最强，呈棕黄色，斑点状；胞浆阳性反应稍弱，呈黄色，胞核弱阳性反应或呈阴性，突起未见明显着色，阳性细胞层次清楚，在12h～7d间变化不明显。手术组：脑出血后12h血肿周围、皮质处水肿区的神经细胞NR1、GluR2的阳性表达明显增加，1d达到高峰，3d、7d时仍强于正常。治疗组：脑出血后12h～7d间血肿周围、皮质处神经细胞NR1的阳性表达明显减少，而GluR2的阳性表达则明显增加，1d达到最高峰，3d、7d时仍强于组。GluR2、NR1的阳性表达在1-7d间与组相比均有统计学意义（P＜0.05）。3．脑组织含水量的变化手术组脑组织含水量在出血后12h～1d时增加、3d时水肿达到峰值、7d明显减轻，治疗组较手术组则明显减轻（P＜0.05），对照组在12h～7d间变化不明显。结论1．拉莫三嗪可以减轻实验脑出血大鼠脑组织含水量。2．拉莫三嗪可以降低血肿周围、皮质处脑组织NR1的表达，同时升高GluR2的表达水平。3．脑出血后NR1、GluR2的动态变化规律提示NR1、GluR2的表达与脑水肿、脑损伤的发生发展密切相关，可能是引起脑出血继发性损伤的重要因素之一。4．拉莫三嗪发挥脑保护作用的机制可能是通过降低NR1的表达，升高GluR2的表达水平而发挥拮抗兴奋性氨基酸毒性作用。5．提示早期积极控制脑出血后NR1的过度表达同时增强GluR2的表达，将是预防和减轻脑损伤的有效途径之一。