论文摘要
【目的】我们通过从鸡胚屈趾肌腱提取的原代腱细胞，经传代扩增后种植在经过物理和化学方法处理后的SIS材料上，以SIS作为支架材料构建组织工程肌腱。将其植入成年鸡的屈趾肌腱缺损部位，比较组织工程肌腱与单纯用SIS替代缺损肌腱之间是否存在差别。初步探讨猪小肠粘膜下层作为组织工程肌腱支架的可行性。【方法】（1）取猪小肠的空肠部分，经反复冲洗后，将其截成每段10cm。纵行剖开，用包裹纱布的刀柄刮去小肠的粘膜层，再翻过来，刮去浆膜层和肌层，尽量刮除彻底。经化学处理后，将小肠粘膜下层卷曲成轴，直径为1.5～2.0mm，长度2.0cm，用11／0显微缝合线在小肠粘膜下层的游离部分缝合3～4针固定，冻干后进行真空包装，然后进行γ射线辐照。（2）取15只19天的罗曼鸡胚趾深屈肌腱，用酶消化方法体外分离培养肌腱细胞，并进行传代扩增。（3）对各代肌腱细胞的活性进行比较。并选取第一代肌腱细胞进行MTT比色实验，并利用所得结果绘制肌腱细胞生长曲线。（4）选取活性高的细胞以5×106／ml的密度种植在SIS上，体式显微镜下观察细胞与材料粘附情况。（5）将24只成年罗曼鸡分成两组，分别为复合细胞的SIS组（实验组）和无细胞的SIS组（对照组），每组各12只，以鸡左趾作为研究对象。用手术刀在鸡中趾中、末节趾骨的屈侧正中做切口，长约4cm，逐层切开皮肤、皮下组织、肌腱附属组织，暴露趾深屈肌腱。尽量牵拉趾深屈肌腱，在其近端用细针头固定，在距离固定处5mm部位切断该肌腱。将准备好的SIS材料的一个末端与肌腱的近断端以八字缝合、在两端加固两针。再测量2cm的长度，离断趾深屈肌腱，将SIS的另一端与肌腱的远断端缝合。缝合伤口，纱布包扎。跖趾关节背伸、趾间关节屈曲位石膏托固定。两组动物隔离散养，2周后拆除石膏托。（6）分别于术后第3、6、9周作为时间点，每个时间点处死8只动物（实验组和对照组各4只），切取左趾移植物，进行检测。（7）肉眼观察材料。（8）体式显微镜检查。（9）石蜡切片、病理学检查。（10）于各时间点对标本进行力学测试，所得数据均采用SPSS11.0统计软件进行处理和分析。【结果】1．对原、传代肌腱细胞培养和倒置显微镜下观察，细胞在第2～3代细胞活性高，且外形规则，细胞分泌胶原的能力强。实验中我们选择第二代细胞与材料复合。2．MTT检测结果显示，肌腱细胞在第1和第2天生长迅速，到第3天后有所减缓，处于细胞增殖的平台期，到第6天后细胞总数有下降的趋势。3．体式显微镜检查发现，材料植入动物体内后降解速度很快，第3周SIS的60％已经降解，第6周时SIS降解了90％，并且降解后的空缺部分完全被新增组织所替代。第9周时材料已经完全降解，仅能看到新生组织。4．组织学检查结果显示，实验组在第3周时有较多的成纤维组织，而对照组则很少，材料内主要为大量的炎性细胞。对照组在6、9周时成纤维组织的数量和排列特征均不如实验组。5．力学检测结果为，第3周时，实验组和对照组的抗拉伸强度的均数标准差分别为169.1±8.5和169.8±9.1，t=-0.116，P＞0.05，两组材料无统计学差异。第6周时分别为197.3±9.1，172.7±13.7，t=2.974，P＜0.05，第9周时分别为243.5±7.8，192.7±9.3，t=8.336，P＜0.05。第6周和第9周时实验组和对照组的标本在抗拉伸强度上具有统计学意义。【结论】（1）前3代肌腱细胞增殖能力强，2～3代的肌腱细胞既能满足一定细胞数量，又能保证细胞有良好的增殖能力。因而我们选择第2代肌腱细胞作为组织工程肌腱的种子细胞。（2）肌腱细胞老化、凋亡的时间早，可传代数少。（3）SIS在体内降解迅速，并且SIS的降解率与新组织长入速度能够保持一致。（4）复合细胞的SIS肌腱替代物优于单纯SIS替代肌腱的作用，SIS具有很好的生物相容性和力学强度，有可能成为肌腱组织工程的一种理想的支架材料。