鹅H5亚型禽流感病毒HA1-iELISA抗体检测技术研究

论文摘要

禽流感（Avian Influenza,AI）是由正粘病毒科A型流感病毒（Avian Influenza Virus,AIV）引起的禽类烈性传染病,可感染多种动物和人,是一种重要的人畜共患病病原。为预防和控制AIV,对天然储存宿主——水禽进行长期监测,具有重要的生态学和公共卫生学意义。本研究以H5N1亚型AIV为对象,在已构建的pETHA1-H5的基础上,进行HA1蛋白的原核表达研究。将pETHA1-H5转化大肠杆菌BL21（DE3）,通过IPTG诱导,实现了重组H5亚型HA1蛋白的表达,并以包含体形式存在。HA1重组蛋白经Ni2+-NTA亲和层析纯化后,1 L培养物能获22.75 mg。Western-blot和Dot-ELISA分析表明HA1重组蛋白能与不同禽类（鸡、鸭和鹅）H5亚型流感病毒阳性血清发生特异性反应,而与其他禽类病毒血清无交叉反应性,证明了HA1重组蛋白具有良好的免疫反应性。采用纯化的重组H5亚型AIV血凝素（HA1）蛋白为检测抗原,辣根过氧化物酶（HRP）标记兔抗鹅IgG为二抗,建立了H5亚型禽流感病毒血凝素间接酶联免疫吸附试验检测技术（HA1-iELISA）。通过优化试验确定了最佳工作条件:抗原包被浓度为2μg/ml,37℃作用1 h后,4℃放置12 h,血清和酶标抗体作1:100倍、1:1000倍稀释,以0.05 M pH8.5的Tris-HCl缓冲液为包被液,5%脱脂奶/PBS为封闭液,0.1%BSA/PBS为稀释液,血清与酶标抗体的最佳反应条件为37℃孵育45 min,底物显色条件为室温5-10 min。参考HI结果,对417份鹅血清的HA1-iELISA S/P值进行ROC分析,确定以0.25为阴阳性血清临界值,此时诊断敏感性和特异性分别为91.15%、91.1%。交叉试验表明重组HA1抗原不与其它水禽类易感病毒血清反应,有较强的抗原特异性。此法稳定性和重复性较好的,批内、批间变异系数能控制在12%以内。采用HI、VN和全病毒-ELISA和HA1-iELISA方法对100份鹅血清进行检测,结果显示HA1-iELISA与其它三种方法的符合率为90%左右,有较高的敏感性和特异性,表明此法适用于临床免疫鹅群H5亚型AIV抗体的监测。为开发出保存期长、稳定可靠的HA1-iELISA试剂盒,对盒内各成分的溶液环境、存放条件进行试验。结果表明,经真空干燥处理的酶标板在低温保存条件下可保持良好的抗原活性;各工作溶液在添加保护剂和稳定剂后保存时间明显提高;以上述组成成分最短保存时间为界组装的HA1-iELISA试剂盒在4℃条件下可保存时间为6个月。本研究所建立的快速、特异的HA1-iELISA方法适用于H5亚型AIV抗体的血清学诊断,并为进一步商业试剂盒的研制提供基础。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 引言
• 第一章 文献综述
• 1.1 禽流感病毒的历史
• 1.2 禽流感的亚型分类和命名
• 1.3 国外禽流感流行情况
• 1.4 国内禽流感情况
• 1.5 禽流感病毒的病原学特征
• 1.5.1 禽流感病毒的形态和结构
• 1.5.2 禽流感病毒的理化特征
• 1.5.3 禽流感病毒培养条件
• 1.6 禽流感病毒的分子生物学特征
• 1.6.1 禽流感病毒基因组蛋白的功能
• 1.6.2 禽流感病毒的抗原变异
• 1.6.3 禽流感病毒毒力的分子基础
• 1.7 禽流感病毒的流行特点
• 1.7.1 宿主多样化
• 1.7.2 水禽和鸟类可能是AIV 的主要传染源
• 1.7.3 AIV 的跨物种传播
• 1.8 禽流感的检测方法
• 1.8.1 病毒的分离
• 1.8.2 血清学检测
• 第二章 重组H5 亚型禽流感病毒HA1 抗原的制备
• 2.1 材料
• 2.1.1 质粒、菌株和血清
• 2.1.2 酶与生化试剂
• 2.1.3 常用缓冲液
• 2.2 方法
• 2.2.1 pET-28a H5/HA1 的诱导表达
• 2.2.2 表达产物的SDS-PAGE 电泳检测
• 2.2.3 重组HA1 蛋白的纯化
• 2.2.4 Western-blot 鉴定表达蛋白反应性
• 2.2.5 纯化重组HA1 蛋白的特异性试验
• 2.3 结果
• 2.3.1 重组HA1 蛋白的表达
• 2.3.2 重组HA1 蛋白的纯化
• 2.3.3 Western-blot 鉴定HA1 蛋白的反应性
• 2.3.4 重组HA1 蛋白的特异性
• 2.4 讨论
• 第三章 兔抗鹅IGG-HRP 酶标抗体的制备与检测
• 3.1 材料
• 3.1.1 试剂和实验动物
• 3.1.2 常用缓冲液
• 3.2 方法
• 3.2.1 鹅IgG 的提纯及检测
• 3.2.2 兔抗鹅IgG 的制备
• 3.2.3 辣根过氧化物酶标记兔抗鹅IgG
• 3.2.4 酶标抗体的质量检测
• 3.3 结果
• 3.3.1 鹅IgG 的制备
• 3.3.2 兔抗鹅IgG 的制备
• 3.3.3 兔抗鹅IgG 的HRP 标记试验
• 3.4 讨论
• 第四章 鹅H5 亚型禽流感抗体HA1-IELISA 检测方法的建立
• 4.1 材料
• 4.1.1 ELISA 抗原
• 4.1.2 HRP 标记兔抗鹅IgG
• 4.1.3 血清
• 4.1.4 试剂和仪器
• 4.1.5 常用缓冲液
• 4.2 方法
• 4.2.1 HA1-iELISA 操作程序
• 4.2.2 HA1-iELISA 最佳工作条件的确定
• 4.2.3 HA1-iELISA 判定标准的确定
• 4.2.4 HA1-iELISA 特异性试验
• 4.2.5 HA1-iELISA 稳定性和重复性试验
• 4.2.6 HI、VN、全病毒ELISA 及HA1-iELISA 监测疫苗免疫鹅抗体水平变化规律
• 4.3 结果
• 4.3.1 HA1-iELISA 最佳反应条件的确定
• 4.3.2 HA1-iELISA 判断标准的确定
• 4.3.3 HA1-iELISA 特异性试验
• 4.3.4 HA1-iELISA 重复性试验
• 4.3.5 HI、VN、全病毒ELISA 及HA1-iELISA 检测免疫鹅H5 亚型AIV 抗体
• 4.4 讨论
• 第五章 水禽H5 亚型禽流感抗体检测试剂盒组装及保质期试验
• 5.1 材料
• 5.1.1 抗原、酶标抗体和血清
• 5.1.2 试剂与仪器
• 5.1.3 常用缓冲液
• 5.2 方法
• 5.2.1 酶标板的制备及保存期试验
• 5.2.2 标准阴性、阳性血清工作液的制备和保存期试验
• 5.2.3 HRP 标记兔抗鹅IgG 工作液的制备和保存期试验
• 5.2.4 底物的制备和保存期试验
• 5.2.5 样品稀释液的制备和保存
• 5.2.6 洗涤液的制备和保存
• 5.2.7 终止液的配制
• 5.2.8 试剂盒的组装
• 5.3 结果
• 5.3.1 酶标板在不同保存条件下的保质时间
• 5.3.2 标准阳性、阴性血清工作液保存期
• 5.3.3 HRP 标记兔抗鹅IgG 工作液的保存期
• 5.3.4 底物的保存期试验
• 5.3.5 其它溶液的保存
• 5.3.6 试剂盒的组装
• 5.4 讨论
• 第六章 结论
• 参考文献
• 附录 常用缓冲液
• 致谢
• 作者简历