猪抗病相关基因IRGC、MX1的鉴定、多态性分析及在优质猪品系中的应用研究

论文摘要

随着分子标记技术的应用和发展,分子标记辅助选择和渗入等分子育种技术与常规育种方法相结合极大地加速了猪遗传改良的进程。生物信息学的发展和公共数据资源库的共享,为分离、定位和筛选具有影响猪性状的基因提供了新的思路。本论文通过候选基因的方法,并结合猪的EST信息和比较基因组的策略,分离鉴定猪两个与抗病相关的新基因,并对基因与部分性状进行了关联分析和结构功能域的预测,取得了如下结果:1.依据候选基因法,从GenBank中搜索猪的同源EST,由EST构成的连接群（contig）设计引物,从大白猪cDNA中分离了两个基因immunity-related GTPase family,cinema（IRGC）和myxovirus（influenza virus）resistance 1（MX1）,长度分别为1518bp和2387bp,将IRGC序列提交到GenBank收录号分别为EU 703776。2.根据已获得的cDNA序列设计引物,分别以大白、长白、梅山、通城、清平猪DNA作为模板进行扩增、克隆并测序,拼接后获得IRGC基因的基因组序列,长度为3345bp,序列提交到GenBank收录号为EU 696780。获得了MX1基因的第12内含子序列,序列比对发现G175A突变引起HpaⅡ酶切多态性。3.采用半定量RT-PCR方法检测了IRGC和MX1基因在二月龄大白猪心、肝、脾、肺、肾、小肠、胃、脂肪、肌肉、子宫等10个组织中的表达情况,结果表明IRGC在各个组织的表达量都很低,MX1基因在心、脾、胃、子宫、肌肉中表达量较高,在肝、小肠、脂肪中等表达量较低。4.对IRGC和MX1基因的氨基酸序列进行了功能结构域预测,利用网上CLUSTAL W软件进行多序列比对,结果发现猪IRGC蛋白与犬的相似性达到了95%,与牛的相似性达到了93%与人和大猩猩相似性达到90%;猪MX1蛋白与牛的相似性达到了80%,与人相似性达到78%,猩猩相似性达到77%,犬的相似性达到了76%,采用DNASar软件的MegAlign程序进行进化树构建。5.采用PCR-RFLP方法检测了MX1基因第12内含子的多态性在不同猪种中的分布,结果发现:MXⅠ基因在大白、长白、梅山、通城、清平、鄂西等六个猪种中等位基因B占优势,等位基因频率分别为0.83,0.89,1.00,0.94,0.87,0.89。MX1基因第12内含子PCR-HpaⅡ-RFLP在295头大梅F2代资源家系进行性状关联分析表明:MX1基因对屠宰率、瘦肉率、眼肌高相关显著（p＜0.05）,屠宰率、眼肌高加性效应显著（p＜0.05）;眼肌高显性效应显著（p＜0.05）瘦肉率显性效应显著极显著（p＜0.01）。AB基因型有较高的眼肌高、屠宰率、瘦肉率。6.在大白群体中通过分子生物学技术与常规育种技术相结合的育种新技术体系,G2与G0相比群体繁殖性状基本保持一致,抗病性能有一定的提高,日增重和达100Kg日龄、瘦肉率、背膘厚、眼肌面积进展显著,MX1基因对日增重相关显著（p＜0.05）,日增重加性效应显著（p＜0.05）。在杜洛克群体中G2与G0相比群体繁殖抗病性能性状基本保持一致,日增重、达100Kg日龄、料重比、背膘厚进展显著,MX1基因对日增重和眼肌面积相关显著（p＜0.05）,日增重显性效应显著（p＜0.05）,眼肌面积加性效应显著（p＜0.05）。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 缩略词表
• 资源家系测定性状的英文缩写
• 第一章 文献综述
• 1 常用分子遗传标记
• 1.1 RFLP标记
• 1.2 DNA指纹标记
• 1.3 RAPD标记
• 1.4 微卫星标记
• 1.5 AFLP标记
• 1.6 PCR-SSCP标记
• 2 新基因分离方法
• 2.1 根据EST分离基因
• 2.2 比较基因组学在分离新基因中的应用
• 2.3 位置克隆在分离新基因中的应用
• 3.抗性的遗传与抗病育种
• 3.1 抗性的遗传
• 3.2 抗性基因
• 3.2.1 主要组织相容性复合体
• 3.2.2 NRAMP1基因
• 3.2.3 干扰素基因
• 3.2.4 大肠杆菌F18受体
• 3.3 抗病育种的途径
• 3.3.1 直接选择
• 3.3.2 间接选择
• 4 拟分离基因的研究进展
• 4.1 免疫相关蛋白家族C（immunity-related GTPase family,cinema,IRGC）基因
• 4.2 抗黏病毒1（myxovirus resistance 1,MXI）基因
• 5 本研究的目的和意义
• 第二章 材料与方法
• 1 试验材料
• 1.1 试验样品及性状测定
• 1.1.1 DNA样品
• 1.1.2 组织样品
• 1.1.3 试验猪群及性状测定
• 1.2 主要仪器和设备
• 1.3 主要药品及试剂
• 1.4 缓冲液和常用试剂的配制
• 2 试验方法
• 2.1 猪基因组DNA的提取
• 2.2 基因组DNA的浓度测定和质量检测
• 2.3 利用RT-PCR方法扩增cDNA片段
• 2.3.1 总RNA的提取
• 2.3.2 cDNA第一链的合成
• 2.3.3 RT-PCR反应
• 2.3.4 RT-PCR反应产物的检测
• 2.4 候选基因的确定及引物设计
• 2.4.1 候选基因的确定
• 2.4.2 引物设计
• 2.5 PCR产物的回收、纯化、克隆测序
• 2.5.1 PCR产物回收与纯化
• 2.5.2 回收DNA片段与载体的连接
• 2法制备感受态）'>2.5.3 感受态细胞的制备（CaCl₂法制备感受态）
• 2.5.4 连接产物的转化
• 2.5.5 阳性克隆子鉴定及测序
• 2.6 生物信息学分析相应软件
• 2.7 猪候选基因组序列的扩增及部分SNP的PCR-RFLP检测
• 2.7.1 引物设计
• 2.7.2 PCR产物的酶切及检测
• 2.8 组织表达谱分析
• 3 统计分析
• 3.1 分子标记在不同猪种中的等位基因频率及基因型频率计算
• 3.2 分子标记的基因效应分析
• 第三章 结果与分析
• 1 总RNA的提取
• 2 猪IRGC基因
• 2.1 根据猪EST信息设计特异性引物及RT-PCR扩增结果
• 2.2 猪IRGC基因cDNA序列生物信息学分析结果
• 2.3 推导的IRGC蛋白质的基本特征分析
• 2.3.1 蛋白质的结构及功能域分析
• 2.3.2 IRGC编码氨基酸的保守结构域及3-D结构预测结果
• 2.3.3 猪IRGC蛋白与部分物种IRGC的进化关系
• 2.4 猪IRGC基因组序列的克隆、测序和序列分析
• 2.5 猪IRGC基因的组织表达谱分析
• 3 猪MX1基因
• 3.1 根据猪EST信息设计特异性引物及RT-PCR扩增结果
• 3.2 猪MX1基因cDNA序列生物信息学分析结果
• 3.3 推导的MX1蛋白质的基本特征分析
• 3.3.1 蛋白质的结构及功能域分析
• 3.3.2 MX1编码氨基酸的保守结构域及3-D结构预测结果
• 3.3.3 猪MX1蛋白与部分物种MX1的进化关系
• 3.4 猪MX1基因的组织表达谱分析
• 3.5 猪MX1基因组序列的克隆、测序和序列分析
• 3.6 猪MX1基因第12内含子遗传变异多态性检测
• 4 猪MX1基因在优质猪品系中的应用研究
• 4.1 猪MX1基因多态性在不同猪群中的分布及应用
• 4.2 猪MX1基因在大梅F2代生产中的应用
• 4.3 MX1基因标记辅助选择技术在大白猪选育中的应用
• 4.3.1 大白猪繁殖性能与抗病性能的选育
• 4.3.2 大白后备猪生长发育后备猪生长发育测定结果
• 4.3.3 MX1分子标记在大白猪群体中的应用
• 4.4 MX1基因标记辅助选择在杜洛克中选育中的应用
• 4.4.1 杜洛克繁殖性能的选育
• 4.4.2 杜洛克后备猪生长发育测定结果
• 4.4.3 MX1分子标记在杜洛克猪群体中的应用
• 第四章 讨论
• 1 分离猪基因cDNA序列的策略
• 2 候选基因序列以及基因结构的分析
• 3 候选基因预测的蛋白结构域、功能位点的分析
• 4 候选基因的SNPs研究
• 5 SNPs的生物学效应
• 6 猪MX1在不同群体中基因型频率分布和遗传效应分析
• 7 关于IRGC和MX1蛋白的进化树分析
• 8 组织表达谱分析
• 9 分子标记辅助选择在优质猪品系选育中的应用
• 小结
• 参考文献
• 附录
• 猪IRGC基因的基因组序列
• 猪IRGC基因的eDNA序列
• 致谢