重组蛋白hCH-2的PEG修饰及其初步特性研究

论文摘要

蛋白药物的PEG修饰是第二代生物制药的重要内容,PEG修饰蛋白药物克服了天然蛋白药物的诸多不足,而被赋予了低免疫原性、高酶稳定性、长半衰期等新特性,已逐渐成为临床上广泛应用的新一代高效、低毒的治疗药物。本项目完成了PEG修饰hCH-2项目临床前的大部分基础研究工作,选择了合适的PEG修饰剂,优化并放大验证了修饰工艺和纯化工艺,获得了单链PEG-hCH-2目标产物,建立了单链PEG-hCH-2原液生产的质控方法和质量标准,探索了单链PEG-hCH-2的初步特性,为开发hCH-2的长效PEG修饰药物奠定了基础。具体内容主要包括以下几个方面:（1）利用高效液相色谱技术,建立了一种快速、方便、准确和稳定的定量检测PEG修饰反应液中微量PEG-hCH-2和hCH-2的反相高效液相色谱方法。该方法的分离基础为PEG化hCH-2疏水性的改变,色谱柱为C8反相柱（250mm×4.6mm,300?,5μm）,流动相A为水-TFA（999∶1）,流动相B为100%乙氰,流速为1.0ml/min,线性梯度洗脱和等度洗脱相结合,柱温为30℃,检测波长为280nm。在0.049-0.456mg/ml和0.112-1.796 mg/ml浓度范围内,PEG-hCH-2和hCH-2的浓度与色谱峰峰面积均呈现良好线性关系,回归方程分别为y=2.11×106x-3.30×104和y=1.08×106x-8.45×103,线性相关系数r分别为0.9997和1.0000,最低检测浓度分别为0.044 mg/ml和0.056 mg/ml,日内和日间RSD（n=6）分别为0.50-2.18%和0.40-2.21%。平均回收率分别为98.01% （n=3,RSD为0.72-2.62%）和97.80% （n=3,RSD为0.56-2.32%）。本方法克服了常用的SDS-PAGE、SPF、TNBS等方法的重现性、精度差以及检测时间长等不足,完全可用于工业化大生产质量控制过程中PEG-hCH-2的测定。（2）根据hCH-2本身的结构特性,选择分子量为20kD的链式琥珀酸琥珀酰亚胺酯类mPEG对hCH-2分子中赖氨酸的ε氨基和/或N末端氨基进行非定点PEG修饰。通过PEG修饰hCH-2的单因素影响研究,获得较适宜的起始pH值为8.0-8.5、摩尔比为1:5、缓冲液浓度为25-50mmol/l、hCH-2浓度为0.5mg/ml和反应时间为4h;利用L9（34）正交试验对起始pH值、hCH-2与PEG的摩尔比、hCH-2浓度和缓冲液浓度进行了优化,获得优化的起始pH值为8.5、hCH-2与PEG的摩尔比为1:7、hCH-2浓度为0.75mg/ml和缓冲液浓度为50mmol/l;保持温度25℃、反应时间4h、反应总体积0.5ml和转速200r/min,进行优化修饰条件的验证试验研究和放大试验研究,结果表明:优化的PEG修饰工艺条件具有良好的稳定性和可操作性,可使反应液中单链PEG-hCH-2含量可达0.25mg/ml,单链PEG-hCH-2修饰

论文目录

• 中文摘要
• 英文摘要
• 1 绪论
• 1.1 问题的提出及研究意义
• 1.2 蛋白质药物PEG 修饰的国内外研究现状
• 1.3 本文研究的目的和研究内容
• 2 PEG 化重组蛋白hCH-2 含量HPLC 测定的方法建立
• 2.1 概述
• 2.2 实验部分
• 2.3 实验结果
• 2.4 讨论
• 2.5 本章小结
• 3 重组蛋白hCH-2 的PEG 修饰工艺研究
• 3.1 概述
• 3.2 实验部分
• 3.3 实验结果
• 3.4 本章小结
• 4 PEG 化重组蛋白hCH-2 的分离纯化工艺研究
• 4.1 概述
• 4.2 实验部分
• 4.3 实验结果
• 4.4 本章小结
• 5 PEG 化重组蛋白hCH-2 的质控方法和质量标准研究
• 5.1 概述
• 5.2 实验部分
• 5.3 实验结果
• 5.4 本章小结
• 6 PEG 化重组蛋白hCH-2 的初步特性研究
• 6.1 概述
• 6.2 实验部分
• 6.3 实验结果
• 6.4 本章小结
• 7 全文结论与展望
• 7.1 主要结论
• 7.2 后续研究工作展望
• 附件1.2 蛋白质药物PEG 修饰的国内外研究现状
• 致谢
• 参考文献
• 附录 1 本文主要缩写词