进行性斑状色素减少症致病菌分子生物学鉴定及发病机制初步探讨

论文摘要

背景：进行性斑状色素减少症（progressive macular hypomelanosis，PMH）是一种易被误诊的色素减退性皮肤病，其临床特征为躯干部对称出现边界不清的圆形、椭圆形色素减退斑，并常于躯干中线处融合成片状。它不痒不痛也无炎症。20世纪80年代，为了描述一种发生于法国人身体上的色素紊乱皮肤病，Guillet等人首次提出了进行性斑状色素减少症，世界各地陆续均有报道，近年来国内分别以“花斑癣样色素减退”、“青少年特发性浅色斑”进行过报道。但目前缺乏公认的诊断标准，且该病的发病机制尚不清楚，主要由以下四种假说：○1基因‘融合’学说○2遗传学说○3真菌感染学说○4痤疮丙酸杆菌学说；目前较为认可的是痤疮丙酸杆菌感染学说[2]，但国内尚无对该病致病菌及作用方式相关方面的研究。目的：对进行性斑状色素减少症（PMH）患者所分离的致病菌进行初步鉴定和分析；并将PMH患者皮损分离出的痤疮丙酸杆菌加入角质形成细胞（HaCat株）的培养体系，以痤疮患者皮损处分离出的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌标准株（NCTC737）做对照组，来观察不同来源细菌对HaCat细胞株分泌IFN-γ、IL-6、TNF-α细胞因子的影响，从而推测可能的发病机制。方法：需氧法、厌氧法分别从PMH及痤疮患者皮损处培养病原菌，应用革兰氏染色、ATB Rapid ID32A系统鉴定及细菌16sDNA测序鉴定，将测序结果通过Blast比对，与已知菌进行同源性分析，确定细菌种属。然后用DNASTAR建立细菌的系统发育树。取正常人（色素痣患者）皮肤细菌培养做对照。将PMH患者皮损分离出的痤疮丙酸杆菌加入角质形成细胞（HaCat株）的培养体系，以痤疮患者皮损处分离出的痤疮丙酸杆菌及痤疮丙酸杆菌标准株（NCTC737）做对照组，来观察不同来源细菌对HaCat细胞株分泌IFN-γ、IL-6、TNF-α细胞因子的影响。结果：1.WOOD灯观察41例PMH患者中35例皮损区灯下可见局限性点状红色荧光，占85.4%，正常皮肤处未见点状红色荧光。295例寻常型痤疮患者中，195例粉刺型中，其中90例可见红色荧光，183例丘疹型中痤疮患者中17例可见红色荧光。2.病原菌的分离培养和鉴定11例PMH患者正常皮肤处取材培养，在常规血平板和厌氧血平板中均未见菌落形成；皮损区取材作需氧及厌氧培养，需氧培养的未发现有菌落生成，厌氧培养有9例有菌落形成，菌落为圆形、白色、不透明、光滑、不溶血伴有臭味，Wood灯下表现为红色荧光，革兰氏染色阳性，短棒状杆菌、无芽孢、荚膜和鞭毛，经ATB Rapid ID32A系统鉴定为痤疮丙酸杆菌。用厌氧培养法从13例寻常型痤疮皮损做培养，9例培养出革兰氏阳性菌，经鉴定7株均为痤疮丙酸杆菌，1株为肠杆菌，1株为Lysinibacillus菌。正常人（色素痣患者）皮肤组织培养未见细菌生长。3.16sDNA测序分析及系统发育树的建立分别对来自面部寻常型痤疮皮损处的痤疮丙酸杆菌和PMH背部皮损处培养的痤疮丙酸杆菌进行16sDNA测序，测序结果经Blast分析16株为痤疮丙酸杆菌（9株来自于PMH患者，7株来源于痤疮患者），在NCBI上选取痤疮丙酸杆菌标准株（DSM16379,NR040847.1）与颗粒丙酸杆菌标准株（DSM20700,NR025276.1）一起做phylogenetic tree和sequence distances后发现来自PMH皮损区的菌株为痤疮丙酸杆菌，与痤疮丙酸杆菌标准株相似度均大于99.7%。4.痤疮丙酸杆菌对HaCat细胞分泌细胞因子的影响PMH分离的痤疮丙酸杆菌与HaCat株共培养分泌的IFN-γ、IL-6量较空白对照组含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；较标准菌株NCTC737组含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）；较痤疮患者分离出的痤疮丙酸杆菌株含量升高，差异有统计学意义（P＜0.05）PMH分离的痤疮丙酸杆菌与HaCat株共培养分泌的TNF-α量较空白对照组含量降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；较标准菌株NCTC737组含量降低，差异无统计学意义（P＞0.05）；较痤疮患者分离出的痤疮丙酸杆菌株升高，差异无统计学差异（t=1.47,P＞0.05）结论：进行性斑状色素减少症皮损区可以分离自痤疮丙酸杆菌，而周围正常皮肤及正常人的正常皮肤未能培养出痤疮丙酸杆菌；P.anes致PMH患者色素减退，可能是由于影响角质形成细胞分泌如IFN–γ、 IL-6等细胞因子，从而影响黑素细胞的生物学活性，影响黑素合成而导致

论文目录

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• ABSTRACT
• 1 引言
• 2 材料与方法
• 2.1. 实验材料
• 2.1.1 实验细胞与细菌
• 2.1.2 试剂
• 2.1.3 仪器与设备
• 2.2 实验内容与方法
• 2.2.1 细菌培养
• 2.2.2 革兰氏染色
• 2.2.3 细胞培养
• 2.2.4 ATB Rapid ID 32A 系统鉴定
• 2.2.5. 16SrDNA 测序分析
• 2.2.6 系统发育树分析
• 2.2.7 痤疮丙酸杆菌与 HaCat 细胞共培养
• 2.2.8 统计方法
• 3.实验结果
• 3.1 临床研究
• 3.2 WOOD 灯观察
• 3.3 病原菌的分离培养和鉴定
• 3.4 16sDNA 测序及序列相似形分析
• 3.5 系统发育树分析
• 3.6 痤疮丙酸杆菌对 HaCat 细胞生长的影响
• 3.7 痤疮丙酸杆菌对 HaCat 细胞分泌细胞因子的影响
• 4. 讨论
• 5. 结论
• 6.下一步工作展望
• 7. 参考文献
• 附录一（个人简历及攻读期成果）
• 附录二（致谢）
• 附录三（综述）
• 参考文献