论文摘要
目的通过体外细胞培养的方法,证实丹参酮ⅡA（TanⅡA）体外抑制人前列腺癌细胞株PC3和DU145生长及诱导凋亡的作用,并进一步分析其对细胞周期和凋亡相关基因蛋白表达的影响。探讨丹参酮ⅡA在PC3和DU145中可能的作用机制,最终希望为晚期前列腺癌的临床治疗提供新选择。方法体外培养人前列腺癌细胞株PC3和DU145,分别用不同浓度的丹参酮ⅡA(2.5,5.0,10.0,20.0mg.L-1)处理细胞24,48,72小时后进行如下指标检测:1.光镜,电镜观察细胞形态改变;2.细胞计数、细胞毒试验（CCK-8法）、集落形成试验检测细胞生长和增殖的抑制情况;3.琼脂糖凝胶电泳分析细胞DNA“梯状”断裂;4.流式细胞术PI染色检测用药前后细胞周期变化;5.Western-blot检测细胞凋亡相关基因蛋白p53,p21,bcl-2,Caspase3的表达改变,探讨药物作用机制。结果1.细胞形态观察:光镜下可见对照组细胞贴壁生长,类圆形或梭形,体积较大,排列紧密,边缘光滑;经10.0mg.L-1丹参酮ⅡA处理后,细胞排列稀疏,细胞体积缩小,胞膜皱缩,成小圆形或不规则形态,并见到较多细胞漂浮于培养基中。随着作用时间延长（24h-48h-72h）,其形态改变的程度逐渐升高;透射电镜可见TanⅡA组细胞发生了凋亡的特征性改变如核固缩、碎裂,凋亡小体形成。2.细胞毒试验:各浓度的丹参酮ⅡA(2.5,5.0,10.0,20.0mg.L-1)对PC3和DU145的生长均有抑制作用,明显强于对照组,其差别有统计学意义（P＜0.05）。此外,试验发现,随作用时间延长和丹参酮ⅡA浓度增加,其生长抑制作用逐渐增强。经双因素方差分析检验,10.1mg.L-1丹参酮ⅡA处理不同时间的细胞存活率之间有统计学差异（P＜0.05）,不同浓度丹参酮ⅡA处理72h后的细胞存活率之间也有统计学差异（P＜0.05）,提示药物作用有明显的时间、浓度依赖性。3.集落形成试验:经丹参酮ⅡA处理后的PC3和DU145细胞集落形成率明显降低,与对照组相比有统计学差异（P＜0.05）。并且随药物浓度上升集落形成率逐渐下降。4.琼脂糖凝胶电泳:经2.5,5.0,10.0 mg.L-1丹参酮ⅡA处理的DU145细胞和5.0,10.0 mg.L-1处理的PC3细胞均发生了DNA“梯状”断裂,而对照组未发生此现象。5.流式细胞术检测细胞周期:经不同浓度丹参酮ⅡA(5.0,10.0,20.0mg.L-1)作用后的PC3和DU145细胞,G0/G1期比例显著升高,S期比例明显减少,细胞凋亡率上升。6.凋亡相关基因蛋白表达检测:Western-blot检测发现,与对照组相比,丹参酮ⅡA可明显上调p21的蛋白表达,下调bcl-2的蛋白表达,并能不同程度上调p53和Caspase3的表达水平。结论丹参酮ⅡA在体外具有明显的抑制前列腺癌细胞株PC3和DU145生长,诱导凋亡的作用,该作用有时间、浓度依赖性.丹参酮ⅡA可能的作用机制是使细胞阻滞于G0/G1期,明显降低细胞增殖指数,并影响凋亡相关基因蛋白的表达,如上调p53,p21,Caspase3的表达,下调bcl-2表达,从而诱导肿瘤细胞发生凋亡。试验表明,丹参酮ⅡA在前列腺癌的临床治疗方面有潜在价值,值得进一步研究探索。
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