幼兔病毒性出血症免疫失败原因及防制措施的研究

论文摘要

兔出血症是家兔的一种烈性传染病,以发病急、传播速度快、死亡率高为特点,并主要感染3月龄以上成年兔,曾给养兔业造成巨大的经济损失。几年以前,通过疫苗注射可较好地控制本病。但是近年来,3月龄以下、甚至2月龄以下幼兔时有发病,给该病的防控提出了新问题。究竟是抗原变异的原因还是免疫程序的问题需要进一步研究。本研究首先对华东三省RHD的病原进行了分子流行病学调查,对三个分离毒株的基因序列、致病性和免疫原性进行了比较,研究了幼兔出血症的免疫程序,并探讨了中药佐剂对疫苗的免疫增强作用和作用机理。本研究的目的,旨在寻找理想的免疫程序和疫苗佐剂,为幼兔出血症的防控提供理论依据。具体内容为以下五个部分:试验Ⅰ、华东三省RHDV的分子流行病学调查为了弄清兔出血症病毒的流行规律,从2005年到2007年对山东、江苏、安徽三个养兔大省的家兔的带毒情况进行了调查。首先建立了RHDV RT-PCR检测方法,按照GenBank上公布的RHDV基因序列设计一对引物,以RHDV发病兔的新鲜兔肝为材料,提取总RNA,进行cDNA的合成和PCR扩增,对扩增产物进行克隆测序,扩增出与预期的269bp大小一致的片段,该产物序列与公布的RHDV基因序列有95.8%～98.5%的同源性。然后对RT-PCR方法的敏感性、特异性和RHDV的脏器分布进行试验。结果表明,RT-PCR方法的敏感性是HA的1×104倍,对RHD发病死亡兔,能从除粪便以外的各种脏器中检测到病毒。运用建立的RT-PCR方法对采集的不同日龄段的兔鼻拭样品和出入境兔肉产品进行检测,同时选择数个分离毒株进行测序和序列比较。结果,400份出入境兔肉产品中没有发现阳性样品,512份鼻拭子中有48份阳性样品,表明兔出血症病毒在华东三省广泛存在,不同日龄段兔之间的带毒率存在显著性差异;而不同年份、不同省份兔之间带毒率差异不显著;序列比较结果发现三株不同序列,其与Genbank上已公布序列的同源性为93.7%～99.6%。试验Ⅱ、幼兔RHDV三个分离株的基因序列、致病性和免疫原性比较为了研究幼兔RHDV与疫苗株RHDV的区别,应用RT-PCR技术对幼兔RHDV的3个分离株（HN、SH、DY株）和疫苗对照FY株进行RT-PCR扩增,同时进行VP60序列测定、序列比对和蛋白质同源性分析;用4个毒株对兔只进行攻毒,记录死亡时间和死亡率,比较致病性差异;用4个毒株制成疫苗,免疫家兔,比较其免疫原性。结果,3个分离株的基因序列同源性为95.2%～97.4%,氨基酸同源性为95.8%～99.3%;4个毒株的致死率、致病病程和病毒血凝性没有显著性差异;4个疫苗免疫后产生的抗体为同一血清型,各个疫苗均可以抵抗其它毒株的攻击,表明幼兔RHDV的3个分离株与疫苗株之间的免疫原性无显著差异。试验Ⅲ、免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平产生的影响试验1通过攻毒实验比较了新西兰家兔0、1、2、3和4log2 5种抗体水平对的病毒性出血症（RHD）的保护效果,结果表明,抗体效价高于3 log2时可产生100%的保护,2 log2的保护率仅为50%。试验2测定了30、35、40、45、50、55和60日龄非免疫兔的母源抗体效价和用RHD组织灭活苗免疫后8周内血清抗体效价的动态变化,结果发现,母源抗体与日龄呈负相关,在30日龄时最高,可以产生有效的保护,在40日龄后已无保护作用;免疫日龄与抗体峰值和有效保护时间呈正相关,30日龄免疫,抗体效价不但不升、反而显著下降,无保护作用;35日龄免疫,抗体峰值较低,有效保护时间仅为2周;大于40日龄免疫,抗体峰值较高,有效保护时间延长。试验Ⅳ、幼兔出血症免疫程序的研究试验1选择35、40、45三种日龄新西兰家兔各30只,每个日龄兔随机均分为5组,对照组注射生理盐水,4个试验组分别注射4种剂量（1mL、2mL、3mL、4mL）的兔病毒性出血症疫苗,对照组注射生理盐水,分别于免疫前及免疫后1～7周内采血测定血清抗体效价的动态变化。结果表明,各日龄兔的2mL、3 mL、4 mL剂量组的抗体上升速度和有效抗体维持时间均显著大于同日龄的1 mL剂量组;35日龄兔的2 mL、3 mL、4 mL剂量组的抗体峰值显著高于1 mL剂量组。35日龄一次性注射疫苗2mL,其抗体效价在多数时间点显著高于二次注射1mL疫苗的抗体效价。试验2比较两种免疫程序的免疫效果,结果表明,1次性免疫2mL组的抗体水平在大多数时间点显著高于两次免疫1mL组。以上结果提示35日龄免疫、注射剂量2 mL为最佳免疫程序。试验Ⅴ、中药佐剂对RHD疫苗的免疫增强作用为了增强兔出血症疫苗的免疫效果,选择4中药成分（黄芪多糖,淫羊藿多糖,蜂胶黄酮,人参皂甙）组成2个复方,分别与兔出血症疫苗混合后免疫幼兔,以铝胶苗和无佐剂苗为对照,分别于免疫后7、14、21、28、35、49天采血,用微量血凝法测定血清抗体的动态变化,用MTT法测定外周血T、B淋巴细胞转化的动态变化;于免疫后63天测定免疫器官指数并进行攻毒试验。结果表明,复方1在部分时间点能显著提高血清抗体效价,复方2在多数时间点能显著提高血清抗体效价;两个复方在第7天显著促进T淋巴细胞转化,在第7～21天显著促进B淋巴细胞转化;两个复方显著增大圆小囊、肠淋巴结器官指数,提高保护率。试验Ⅵ、中药佐剂对淋巴细胞的转化及其IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响为了进一步证实两个中药成分复方佐剂的免疫增强作用,并探讨其作用机理,比较了两个复方对培养的兔外周血淋巴细胞增殖的作用,运用荧光定量RT-PCR方法比较了两个复方对兔外周血淋巴细胞IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响。结果表明,两个中药成分复方在一定的浓度下可以显著促进淋巴细胞增殖,提高IFN-γ、IL-10 mRNA的表达。这可能是两个中药佐剂增强免疫的机理之一。

论文目录

• 摘要
• ABSTRACT
• 符号及缩略语
• 文献综述
• 第一章 兔出血症研究进展
• 1 兔出血症的病原
• 1.1 病毒的分类
• 1.2 病毒的生物学特性
• 1.3 病毒的致病力
• 2 兔出血症的诊断
• 2.1 病理学检查
• 2.2 电镜检查
• 2.3 红细胞凝集试验
• 2.4 间接血凝试验（IHA）
• 2.5 免疫学方法
• 2.6 核酸检测
• 2.7 其它方法
• 3 兔出血症的防控
• 3.1 组织灭活苗
• 3.2 细胞培养疫苗
• 3.3 基因工程苗
• 3.4 免疫程序
• 参考文献
• 第二章 兔出血症疫苗佐剂和中药佐剂的研究进展
• 1 免疫佐剂的分类
• 2 兔出血症疫苗的常用佐剂
• 2.1 铝盐佐剂和油佐剂
• 2.2 中药类免疫增强剂
• 2.3 囊素类免疫增强剂
• 2.4 其它类免疫增强剂
• 3 中药佐剂的研究进展
• 3.1 多糖
• 3.2 皂甙
• 3.3 黄酮
• 参考文献
• 第三章 本研究的选题和目的意义
• 1 幼兔出血症免疫程序研究的迫切性
• 2 中药作为免疫佐剂的可能性
• 3 本研究的目的和意义
• 参考文献
• 试验研究
• 第四章 华东三省RHDV的分子流行病学调查
• 1 材料和方法
• 1.1 样品
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 RT-PCR方法的建立
• 1.4 流行病学调查
• 1.5 数据分析
• 2 结果和分析
• 2.1 RT-PCR方法的建立
• 2.2 兔肉产品的检测
• 2.3 兔鼻拭子样品的阳性检出率
• 2.4 分离三株毒株的分子流行病学
• 3 讨论
• 3.1 关于兔出血症病毒（RHDV）在华东三省的分子流行病学调查分析
• 3.2 RT-PCR方法的建立
• 参考文献
• 第五章 幼兔RHDV三个分离株的基因序列、致病性和免疫原性比较
• 1 材料和方法
• 1.1 病毒
• 1.2 主要试剂和仪器
• 1.3 试剂配置
• 1.4 病毒的处理
• 1.5 疫苗的制备
• 1.6 病毒RNA的提取
• 1.7 RHDV VP60基因序列的比较
• 1.8 分离毒株的致病性比较
• 1.9 分离毒株的免疫原性试验
• 1.10 血清交叉血凝试验
• 1.11 数据处理
• 2 结果和分析
• 2.1 RT-PCR扩增结果
• 2.2 测序结果
• 2.3 核苷酸和氨基酸同源性比较
• 2.4 各毒株之间的遗传进化树
• 2.5 分离毒株的致病性比较
• 2.6 分离毒株的免疫原性比较
• 3 讨论
• 3.1 幼兔出血症发病状况
• 3.2 分离毒株的基因序列和氨基酸序列比较
• 3.3 分离毒株的致病性比较
• 3.4 分离毒株的免疫原性比较
• 参考文献
• 第六章 免疫日龄对兔病毒性出血症抗体水平产生的影响
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 攻毒试验
• 1.3 不同日龄兔母源抗体水平的测定
• 1.4 不同日龄兔免疫试验
• 1.5 抗体效价测定方法
• 1.6 数据处理
• 2 结果和分析
• 2.1 不同抗体效价水平的保护效果
• 2.2 不同日龄兔母源抗体效价的动态变化
• 2.3 不同日龄兔免疫后抗体效价的动态变化
• 3 讨论
• 3.1 抗体效价与保护率的关系
• 3.2 母源抗体的动态变化
• 3.3 免疫日龄对抗体峰值和有效保护时间的影响
• 参考文献
• 第七章 幼兔出血症（RHD）免疫程序的研究
• 1 材料和方法
• 1.1 材料
• 1.2 不同免疫剂量和日龄免疫试验
• 1.3 免疫程序比较试验
• 1.4 抗体效价测定方法
• 1.5 数据处理
• 2 结果和分析
• 2.1 35日龄兔不同剂量组抗体效价的变化
• 2.2 40日龄兔不同剂量组抗体效价的变化
• 2.3 45日龄兔不同剂量组抗体效价的变化
• 2.4 不同免疫程序的抗体效价比较
• 3 讨论
• 3.1 免疫剂量和免疫日龄对抗体效价的影响
• 3.2 不同免疫程序对抗体效价产生的影响
• 参考文献
• 第八章 中药佐剂对RHD疫苗的免疫增强作用
• 1 材料和方法
• 1.1 中药佐剂、疫苗和试剂
• 1.2 动物及分组处理
• 1.3 淋巴细胞转化试验
• 1.4 抗体效价测定方法
• 1.5 免疫器官指数的测定
• 1.6 数据处理
• 2 结果和分析
• 2.1 淋巴细胞增殖的变化
• 2.2 血清抗体效价的动态变化
• 2.3 免疫器官指数的变化
• 2.4 攻毒保护效果
• 3 讨论
• 3.1 中药佐剂对淋巴细胞增殖的影响
• 3.2 中药佐剂对抗体效价的影响
• 3.3 中药佐剂对免疫器官指数的影响
• 3.4 关于半量抗原中药佐剂的免疫效果
• 参考文献
• 第九章 中药佐剂对兔淋巴细胞转化及其IFN-γ、IL-10 mRNA表达的影响
• 1 材料与方法
• 1.1 中药佐剂、试剂和仪器
• 1.2 试剂配置
• 1.3 淋巴细胞增殖的测定
• 1.4 Real-time PCR检测IFN-γ、IL-10 mRNA方法的建立
• 1.5 IFN-γ、IL-10 mRNA表达的测定
• 2 结果和分析
• 2.1 淋巴细胞增殖的变化
• 2.2 Real time PCR检测IFN-γ、IL-10 mRNA方法的建立
• 2.3 淋巴细胞IFN-γ、IL-10 mRNA表达的变化
• 3 讨论
• 3.1 中药佐剂对体外淋巴细胞增殖的影响
• 3.2 中药佐剂对细胞因子mRNA的影响
• 3.3 关于荧光定量RT-PCR检测方法
• 参考文献
• 全文结论
• 致谢
• 攻读博士期间发表的学术论文目录