论文摘要
红火蚁（Solenopsis invicta），是我国新发现的一种具有严重危害的外来生物，其繁殖、适应能力和攻击性非常强，具有很强的入侵性，能造成重大经济、社会危害和环境影响，已经被国际上列为最具入侵性和破坏性的百种外来有害生物之一。在被红火蚁螫伤的病人中，导致严重过敏反应甚至死亡的主要原因是毒液中过敏原所致。目前，由于红火蚁毒素致敏原强致敏能力的分子基础尚不清楚。为此，本文进行了下述几个方面的研究工作：采用反转录PCR（RT-PCR）和套式PCR（nPCR）方法扩增出红火蚁体内毒素蛋白Sol i 1全基因及其活性基因片段Sol i 1a和毒素蛋白Sol i 4基因，克隆到表达载体并成功表达，纯化的重组蛋白有很好的抗原特异性、较高的致敏活性和良好的免疫治疗效果。1红火蚁致敏毒素Sol i 1、Sol i 4基因cDNA序列的克隆与序列测定以成年红火蚁工蚁全蚁中提取的红火蚁总RNA为模板，通过RT-PCR扩增得到红火蚁致敏毒素Sol i 1和Sol i 4基因的cDNA片段，全长分别为1050bp和354bp。测序结果与已报道的cDNA序列进行比较分析。结果表明：致敏毒素Sol i 1与已报道的cDNA序列只有个别碱基差异，同源性高达99％；致敏毒素Sol i 4与已报道的cDNA序列的同源性最高达97％。2红火蚁致敏毒素Sol i 1、Sol i 4基因的生物信息学分析过敏原sol i 1氨基酸序列与发表的过敏原Sol i 1蛋白的序列相似性最高达到99％，与过敏原Ves g 1蛋白的序列相似性达到40％，与毒液磷酸酶A1蛋白的序列相似性达到40％。过敏原Sol i 4氨基酸序列与发表的过敏原Sol i 4.01蛋白的序列相同，与过敏原Sol i 4.02蛋白的序列相似性达97％，与过敏原Sol i 4蛋白的序列相似性达96％，与过敏原Sol g 4蛋白的序列相似性最高达88％，与过敏原Sol i 2蛋白的序列相似性达36％。Sol i l蛋白含346个氨基酸，分子量是38344.7 Da，理论等电点pI 8.67，原子组成是C1723H2631N463O494S12，不稳定系数是32.88，说明该蛋白是一个稳定蛋白（当一个蛋白质的不稳定系数大于40时，则该蛋白质不稳定）。Sol i 4蛋白含118个氨基酸，分子量是13556.2 Da，理论等电点pI 9.83，原子组成是C610H1020N168O164S7，不稳定系数是29.83，说明该蛋白也是一个稳定蛋白。Sol i 1蛋白质结构由5个a-螺旋和4个β-折叠构成，包含3个疏水性区域。Sol i 4蛋白质由3个a-螺旋和6个β-折叠构成，包含2个疏水性区域。Sol i 1蛋白质的氨基酸序列含有一个Pancreatlipaselike（Pancreatic lipase-like enzymes）结构域，存在LIPASESER（Lipases，serine active site）活性位点。Sol i 1属于脂蛋白酶类，是胰脂肪酶属的一种脂肪酶。3红火蚁致敏毒素Sol i 1、Sol i 4基因在原核中的表达、纯化与活性分析以RT-PCR的产物为模板，通过nPCR扩增出Sol i 1活性基因片段Sol i 1a，全长为378bp。Sol i 1a蛋白含125个氨基酸，相对分子质量是13408.2Da，理论等电点pI 7.85。原子组成是C600H923N157O178S7。不稳定系数是29.96，说明该蛋白是一个稳定蛋白。将红火蚁体内毒素蛋白Sol i 1全基因及活性基因片段Sol i 1a和Sol i 4基因分别连接到表达载体pET43.1a上构建重组质粒pET43.1a-Sol i 1、pET43.1a-Sol i 1a和pET43.1a-Sol i 4，经酶切和测序鉴定后转化BL21（DE3）表达菌株，进行IPTG诱导表达，通过SDS-PAGE分析和Western blot检测，得到能与组氨酸单抗发生特异性反应的预期大小的重组蛋白（相对分子质量分别为约99kD、74kD和74kD）；用亲合层析法纯化，将纯化的重组蛋白通过动物试验进行了生物活性分析以及过敏体质治疗研究。兔体致敏试验表明三种重组蛋白都具有活性，兔体蛋白皮试和免疫治疗试验表明三种重组蛋白不仅可以用于过敏性的诊断，而且可以用于免疫治疗。上述具有新意的研究结果，对于探索红火蚁毒素蛋白分子机理，解决用于红火蚁螫伤引起过敏的诊断、治疗以及早期预防的蛋白制剂，研制更加特异红火蚁毒液过敏反应诊断和有效的治疗制剂，具有重要意义。